菌種的分離純化技術——平板劃線法

    劃線的形式有多種，可將一個平板分成四個不同麵積的小區進行劃線,第一區(A區)麵積最小，作為待分離菌的菌源區，第二和第三區(B、C區)是逐級稀釋的過渡區，第四區(D區)，則是關鍵區，使該區出現大量的單菌落以供挑選純種用。為了得到較多的典型單菌落,平板上四區麵積的分配應是D＞C＞B＞A。 

實驗器材 

    大腸杆菌、枯草芽孢杆菌混合菌懸液 

    牛肉膏蛋白腖培養基 

    無菌培養皿，水浴鍋，接種環等。 

實驗步驟 

1．融化培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基放入水浴中加熱至融化。 

2．倒平板：待培養基冷卻至 50℃左右，按無菌操作法倒 2隻平板(每皿約 15m1)，平置，待凝固。 

    倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰；然後用右手手掌邊緣或小指與無名指夾住管(瓶)塞(也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內或三角瓶內的培養基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中)。左手拿培養皿並將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速例入培養基約 15m1，加蓋後輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然後平置於桌麵上，待凝後即為平板。 

3．作分區標記在皿底將整個平板劃分成 A、B、C、D四個麵積不等的區域。各區之間的交角應為120℃左右（平板轉動一定角度約 60℃），以便充分利用整個平板的麵積，而且采用這種分區法可使 D區與 A區劃出的線條相平行，並可避免此兩區線條相接觸。 

4．劃線操作 

(1) 挑取他含菌樣品：選用平整、圓滑的接種環，按無菌操作法挑取少量菌種。 

(2) 劃 A區：將平板倒置於煤氣 （酒精）燈旁,左手拿出皿底並盡量使平板垂直於桌麵，有培養基一麵向著煤氣燈(這時皿蓋朝上， 仍留在煤氣燈旁)， 右手拿接種環先在 A區劃 3—4條連續的平行線(線條多少應依挑菌量的多少麵定)。劃完 A區後應立即燒掉環上的殘菌，以免因菌過多而影響後麵各區的分離效果。在燒接種環時，左手持皿底並將其覆蓋在皿蓋上方(不要放入皿蓋內)，以防止雜菌的汙染。 

(3) 劃其他區：將燒去殘菌後的接種環在平板培養基邊緣冷卻一下，並使 B 區轉到上方，接種環通過 A區(菌源區)將菌帶到 B 區，隨即劃數條致密的平行線。再從 B 區作 C區的劃線。最後經 C區作 D區的劃線，D區的線條應與 A區平行，但劃 D區時切勿重新接觸 A、B 區，以免極該兩區中濃密的菌液帶到 D區，影響單菌落的形成。隨即將皿底放入皿蓋中。燒去接種環上的殘菌。 

5．恒溫培養：將劃線平板倒置，於 37℃ （或 28℃）培養，24hr 後觀察。