實驗目的
學習稀釋平板菌落計數的基本原理和方法。
實驗內容
用稀釋平板菌落計數法對菌懸液進行計數。
實驗原理
平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋之後，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。但是，由於待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可能來自樣品中的 2—3或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數的結果，現在已傾向使用菌落形成單位(cfu)而不以絕對菌落數來表示樣品的活菌含量。
平板菌落計數法雖然操作較繁，結果需要培養一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由於該計數方法的最大優點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用於生物製品檢驗（如活菌製劑），以及食品、飲料和水〔包括水源水〕等的含菌指數或汙染程度的檢測。
實驗器材
釀酒酵母菌懸液
馬鈴薯培養基
1m1 吸管，平皿，試管，試管架，恒溫培養箱等。
實驗步驟
1．無菌器材的準備
(1) 無菌培養皿：取培養皿 9套，包紮、滅菌。
(2) 無菌移液管的準備：取 1m1 移液管，在後部管口處用鐵絲塞入棉花少許（長約 1~1.5cm ），以防將菌液吸出，同時也可避免將外麵的微生物吹入。棉花要塞得鬆緊適宜吹時能通氣但不使棉花滑下為準。然後將移液管尖端放在 4~5cm寬的長紙條一端呈 45o角折疊紙條包住尖端，用左手捏住管身，右手將吸管壓緊，在桌麵上向前滾動，以螺旋式包紮起來，上端剩餘紙條折疊打結後幹熱滅菌。
(3) 無菌水：取 6支試管，分別裝入 4.5m1 蒸餾水，加棉塞，滅菌。
2．樣品稀釋液的製備
3．平板接種培養
平板接種培養有澆注平板培養法和塗布平板培養法兩種方法。
(1) 澆注平板培養法
1) 取樣
-4 -5 -6
用三支 1ml 無菌吸管分別吸取 10 、10 、和 10 的稀釋菌懸液各 1ml，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放 0.2ml。
不要用 1ml 吸管每次隻靠吸管尖部吸 0.2ml 稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個重複平板間的操作誤差。
2) 倒平板
盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒人融化後冷卻至 45℃左右的培養基約 15 毫升／平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養基與菌液混合均勻，而又不使培養基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。待培養基凝固後，將平板倒置於 37℃恒溫培養箱中培養。
由於細菌易吸附到玻璃器皿表麵，所以菌液加入到培養皿後，應盡快倒入融化並己冷卻至 45℃左右的培養基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數。
(2) 塗布平板計數法：
平板菌落計數法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用塗布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是後者先將培養基融化後倒平板，待凝固後編號，並於 37℃左右的溫箱中烘烤 30min，或在超靜工作台上適當吹幹，然後用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種於不同稀釋度編號的平板上，並盡快用無菌玻璃塗棒將菌液在平板上塗布均勻，平放於實驗台上 20—30 min，使菌液滲入培養基表層內，然後倒置於的恒溫箱中培養 24—48h。
塗布平板用的菌懸液量一般以 0.1ml 較為適宜，如果過少，菌液不易塗布開；過多則在塗布完後或在培養時菌液仍會在平板表麵流動，不易形成單菌落。
4．計數
培養 48h後，取出培養平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，並按下列公式進行計算：
每毫升中菌落形成單位(cfu)＝同一稀釋度三次重複的平均菌落數×稀釋倍數×5
一般選擇每個平板上長有 30—300 個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重複對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重複對照平板不能少於三個，這樣便於數據統計，減少誤差。
平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養後所出現的平均菌落數在 50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。
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