實驗目的
1．通過了解不同細菌對不同的生物大分子分解利用情況，從而認識微生物代謝類型多樣性。
2．進一步學習平板接種法及穿刺接種法。
實驗內容
學習微生物對生物大分子的分解利用能力的測定方法。
實驗原理
微生物在生長繁殖過程中，需從外界環境吸收營養物質。外界環境中的小分子有機物質可被微生物直接吸收，而大分子有機物則不能被微生物直接吸收，它們須經微生物分泌的胞外酶將其分解為小分子有機物，才能被吸收利用。例如生物大分於中的澱粉、蛋白質、脂肪等須經微生物分泌的胞外酶，如澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶分別分解為糖、肽、氨基酸、脂肪酸等之後，才能被微生物吸收而進入細胞。
不同微生物分解利用生物大分子能力各有不同。隻有那些能夠產生並分泌跑外酶的微生物才能利用大分子有機物。
現分別介紹澱粉水解、油脂水解、明膠液化和石蕊牛乳等試驗的簡單原理。
1．澱粉水解試驗
某些細菌能夠分泌澱粉酶（胞外酶），將澱粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細菌吸收利用。澱粉被水解後遇碘不再變藍色。
2．油脂水解試驗
某些細菌能夠分泌脂肪酶 （胞外酶），能將培養基中的脂肪水解為甘油和脂肪酸。所產生的脂肪酸，可通過預先加入油脂培養基中的中性紅加以指示[指示範圍 pH6.8（紅）～pH 8.0（黃）。當細菌分解脂肪產生脂肪酸時，培養基中出現紅色斑點。
3．明膠液化試驗
明膠是一種動物蛋白。明膠培養基本身在低於 20℃時凝固，高於 25℃則自行液化。某些細菌能夠產生蛋白酶（胞外酶），將明膠水解成小分子物質，因此培養後的培養基即使在低於20℃的溫度下，明膠也不再凝固，而由原來的固體狀態變為液體狀態。
4．石蕊牛乳試驗
牛乳中主要含有乳糖和酪蛋白。細菌對牛乳的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解利用。牛乳中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊中性時呈淡紫色，酸性時呈粉紅色，堿性時呈藍色，還原時則部分或全部褪色變白。
細菌對牛乳的作用有以下幾種情況：
（1）產酸 細菌發酵乳糖產酸，使石蕊變紅。
（2）產堿 細菌分解酪蛋白產生堿性物質，使石蕊變藍。
（3）腖化 細菌產生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛乳變成清亮透明的液體。
（4）酸凝固 細菌發酵乳糖產酸，使石蕊變紅，當酸度很高時，可使牛乳凝固。
（5）凝乳酶凝固 細菌產生凝乳酶，使牛乳中酪蛋白凝固，此時石蕊呈藍色或不變色
（6）還原 細菌生長旺盛時，使培養基氧化還原電位降低．因而石蕊被還原而褪色。
實驗器材
枯草芽孢杆菌、金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、產氣腸杆菌、粘乳產堿菌、銅綠假單胞菌。
澱粉培養基、油脂培養基、明膠液化培養基、石蕊牛乳培養基。
試管、三角瓶、培養皿、接種針、接種環等。
碘液等。
實驗步驟
1．澱粉水解試驗
(1) 將裝有澱粉培養基的錐形瓶置於沸水浴中融化，然後取出冷卻至 50℃左右，即傾入培養皿中，待凝固後製成平板。
(2) 翻轉平板使底皿背麵向上，用記號筆在其背麵玻璃上劃成兩半，—半用於接種枯草芽孢杆菌作為陽性對照菌，另一半用於接種試驗菌大腸杆菌或產氣腸杆菌。接種時用接種環取少量菌在平板兩邊各劃“十”字。
(3) 將接完種的平板倒置於 37℃恒溫箱中，培養 24h。
(4) 觀察結果時，可打開皿蓋，滴加少量碘液於平板上，輕輕旋轉，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌體周圍出現無色透明圈，則說明澱粉已被水解。透明圈的大小，說明該菌水解澱粉能力的強弱。
2．油脂水解試驗
(1) 將裝有油脂培養基的錐形瓶置於沸水浴中融化，取出並充分振蕩 （使油脂均勻分布），再傾入培養皿中，待凝固後製成平板。
(2) 翻轉平板使底皿背麵向上，用記號筆在其背麵玻璃上劃成兩半。一半用於接種金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌，另一半用於接種實驗菌大腸杆菌或產氣腸杆菌。接種時用接種環取少量菌在平板兩邊各劃線接鍾。
3) 將接種完的平板倒置於 37℃恒溫箱中，培養 24h。
(4) 觀察結果時，注意觀察平板上長菌的地方，如出現紅色斑點，即說明脂肪已被水解，此為陽性反應。
3．明膠液化試驗
(1) 用穿刺接種法分別接種大腸杆菌或產氣腸杆菌於明膠培養基中。
(2) 接種後置於 20℃恒溫箱中，培養 48h。
(3) 觀察結果時，注意培養基有無液化情況及液化後的形狀。
4．石蕊牛乳試驗
(1) 分別接種粘乳產堿菌或銅綠假單胞菌於二支石蕊牛乳培養基中，置於 37℃恒溫箱中培養 7d。另外保留一支不接種石蕊牛乳培養基作對照。
(2) 觀察結果時，注意牛乳有無產酸、產堿、凝固或腖化等反應。注意牛乳產酸、產堿、凝固、腖化各現象是連續出現的，往往觀察某種現象出現時，另一種現象已經消失了。
實驗結果及討論
1．實驗結果
(1) 記錄細菌對生物大分子分解利用的各項實驗及其結果。
(2) 澱粉、油脂、明膠和酪蛋白等生物大分子物質能否不經分解而直接被細菌吸收？為什麽？
(3) 明膠液化試驗中，為什麽隻能將接種後的培養基置於 20℃溫箱中培養？
2．討論
針對實驗原理、步驟、現象進行討論。
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