植物組培的操作技術：滅菌和接種（2）

五.空間滅菌采用紫外線和熏蒸滅菌

1.紫外線滅菌

1)適宜：接種室、超淨台的空間。隻適於空氣和物體表麵的滅菌

2)原理：細菌吸收紫外線後，蛋白質和核酸發生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。

3)特點：紫外線的波長為200～300nm，其中以260nm的殺菌能力最強，但是紫外線的穿透物質的能力很弱，所以隻適於表麵滅菌，且要求距照射物以不超過1.2m為宜．

2.熏蒸滅菌 ‘

1)概念：用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變為氣體狀態擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表麵的微生物。這種方法簡便，隻需空間關閉緊密。

2)原理：使微生物的蛋白質變性，或競爭其酶係統，或降低其表麵張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。

3)特點：一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。另外，消毒劑必須製成水溶狀態。牆壁先噴濕會加強效果。房間要關閉緊密。

4)藥品：常用熏蒸劑是甲醛,熏蒸時，按5～8ml/m³用量，加５g/m³高錳酸鉀促氧化揮發。冰醋酸也可，但不如甲醛。

   6.一些物表用藥劑噴霧或擦拭滅菌

   物體表麵可用一些藥劑塗擦、噴霧滅菌。如桌麵、牆麵、雙手、植物材料表麵等，可用70％的酒精反複塗擦滅菌，１％～２％的來蘇兒溶液以及0.25～１％的新潔爾滅也可以。

   7. 植物材料表麵用消毒劑滅菌 

    植物材料必須經嚴格的表麵滅菌處理，再經無菌操作手續接到培養基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體。

    第一步是清洗 把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水衝洗幾分鍾至數小時，易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內衝洗。洗時可加入洗衣粉或表麵活性物質－吐溫助洗，最後用自來水衝淨。

第二步是表麵浸潤。嚴格要求要在超淨台內完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸30秒左右。 

作用：使植物材料表麵被浸濕。但要把握時間。70%酒精穿透力強，對特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等，以及主要取用內部的材料，可處理稍長一些。

第三步是滅菌劑處理。表麵滅菌劑的種類較多，可根據情況選取(見下表)

表4-2 常用滅菌劑使用濃度及效果比較表

次氯酸鈉和次氯酸鈣在使用前臨時配製，都是利用其分解產生氯氣來殺菌，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好；滅菌效果次於氯化汞，得易於去除。

氯化汞可短期內貯用。氯化汞也稱升汞，為劇毒物質，它由重金屬汞離子破壞微生物蛋白質等來達到滅菌目的；特點是滅菌效果好，得去除殘毒較難，應當用無菌水涮洗8～10次，每次不少於3min，

過氧化氫是分解中釋放原子態氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌後用無菌水涮洗3～4次即可；而

滅菌作法：瀝幹的植物材料轉到較大器皿中，倒入消毒液開始記時，並不斷用玻璃棒輕輕攪動，以驅除氣泡促進接觸和消毒徹底。用傾倒法滅菌液要充分浸沒材料。

   滅菌液中可加吐溫-80或Triton X，使藥劑更易於展布和浸入到的材料表麵。一般加入滅菌液的0.5%，即在100ml加入15滴。

最後一步是用無菌水涮洗，作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。涮洗要每次3min左右，視情況，涮洗3～10次左右。

二、無菌操作

接種時由於有一個敞口的過程，所以是極易引起汙染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內保持定期用1-3%的高錳酸鉀溶液對設備、牆壁、地板等進行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。工作人員進入接種室前雙手必須進行潔淨，先用水和肥皂洗滌，操作前再用70%酒精擦試，操作時雙手不能隨便接觸未經消毒的東西。入室前穿好滅菌的專用實驗服和換托鞋，專用實驗服要經常保持清潔並消毒。頭發帶的灰塵也很多，因此應戴上專用帽子。工作人員的呼吸也是汙染的主要途徑，操作規程過程禁止不必要的談話和咳嗽，可帶上口罩。還要盡量減少工作人員在接種室內的走動。

操作期間,盡量把所用的器皿蓋子蓋好。刀、剪、鑷子等用具，一般在使用前浸泡在７０％的酒精中，用時再在火焰上消毒，待冷卻後使用。每次使用前均需進行用具消毒。工作結束，及時取出接種材料，然後清理台麵，再用５％的來蘇兒或石炭酸全麵噴霧或打開紫外線照射半小時。

三、接種

    接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經切割或剪裁成小段或小塊，放入培養基的過程。以上已敘述接種前的材料表麵的消毒滅菌，現將接種前後的程序連貫地介紹。

(一)將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超淨台上，用消毒劑滅菌，再用無菌水衝洗．最後瀝去水分，取出放置在滅過菌的４層紗布上或濾紙上。

（二）材料吸幹後，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進行適當的切割。如葉片切成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個節的小段。微莖尖要剝成隻含1～2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經常灼燒接種器械，防止交叉汙染。

（三）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養基上。具體操作是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，試管口靠近酒精燈火焰，將管口在火焰上方轉動，讓管口裏外灼燒數秒鍾，若用棉塞蓋口，可先在管口外麵灼燒，去掉棉塞，再燒管口裏麵。然後用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內，輕輕插入培養基上。若是葉片直接附在培養基上，以放1～3塊為宜。至於材料放置方法除莖尖、莖段要正放（尖端向上）外，其它尚無統一要求。放置材料數量現在傾向少放，通過統計認為：對外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣節約培養基和人力，一旦培養物汙染可以拋棄。接完種後，將管口在火焰上再灼燒數秒鍾。若用棉塞，塞好後，包上包口紙，包口紙裏麵也要過火。

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