當材料增殖到一定數量後，就要使部分培養物分流到生根培養階段。若不能及時將培養物轉到生根培養基上，就會使久不轉移的苗子發黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費。因此生根培養是使無根苗生根的過程。最後要使生出的不定根濃密而粗壯。生根可采用1/2或者１／４MS培養基，全部去掉細胞分裂素，並加入適量的生長素(NAA、IBA等)。
用下列方法誘導生根（1）將新梢基部浸入50或100ppm IBA溶液中處理4～8小時。（2）在含有生長素的培養基中培養4～6天。（3）直接移入含有生長素的生根培養基中。上述三種方法均能誘導新梢生根。但前二種方法對新生根的生長發育更有利。而第三種對幼根的生長有抑製作用。因為當根原始體形成後較高濃度生長素的繼續存在，則不利於幼根的生長發育。但這種方法比較可行。
有時采用下列方法就可生根。（1）延長在增殖培養基中的培養時間。（2）有意降低一些增殖倍率，減少細胞分裂素的用量（即將增殖與生根合並為一步）。（3）切割粗壯的嫩枝在營養缽中直接生根，即沒有生根階段。第三種方法省去了一次培養基製作。切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理，但這往往適於一些容易生根的作物。
少數植物生根比較困難的，需要在培養基中放置濾紙橋，使其略高於液麵，靠濾紙的吸水性供應水和營養等，從而誘發生根。
從胚狀體發育成的小苗，常常有原先即已分化的根，可以不經誘導生根階段。但因經胚狀體途徑發育的苗數特別多，且個體較小，所以也常需要一個低濃度或沒有植物激素的培養基培養的階段，以便壯苗生根。
試管內生根壯苗的階段，目的是為了成功地移植到試管外的環境中，使試管苗適應外界的環境因子。不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18～20０Ｃ為宜。溫度過高牽涉到蒸騰加強。以及菌類易滋生等問題。溫度過低使幼苗生長遲緩，或不易成活．春季低溫時苗床可加設電熱線使基質溫度略高於氣溫2～3０Ｃ，這利於生根和促進根係發達，有利於提前成活。
光強應比以前培養有所提高。以強度較高的漫射光為好，約4000Lx左右為宜，以維持光合作用所需光強。但光線過強刺激蒸騰加強，使水分平衡的矛盾更尖銳。
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