實驗目的、要求
（1）學習並掌握細菌、放線菌、黴菌和酵母菌等四大類微生物的稀釋分離、劃線分離等技術。
（2）學習從樣品中分離、純化出所需菌株。
（3）了解四大類微生物的培養條件和培養時間。
以細菌為例
實驗原理
純種分離技術是微生物學中重要的基本技術之一。分離：從混雜的微生物群體中獲得單一菌株純培養的方法。純種（純培養）：一株菌種或一個培養物中所有的細胞或孢子都是由一個細胞分裂、繁殖而產生的後代。
微生物的分離與純化技術的應用：分離具有特殊功能的微生物、優良菌種及純化被汙染的菌種等。
土壤是微生物的大本營，混雜著大量的微生物，從中分離可得到隻含有這一種微生物的純培養。
稀釋分離法有傾注法和塗布法兩種；菌種被其他雜菌汙染時或混合菌懸液常用劃線法進行純種分離。
要獲得某種微生物的純培養，還需提供有利於該微生物生長繁殖的最適培養基及培養條件。
微生物四大類菌的分離培養基、培養溫度、培養時間詳見實驗指導書P67表格。細菌常用牛肉膏蛋白腖培養基，在30-37℃ 溫度下培養1-2天。
平板菌落計數——活菌計數
實驗儀器、材料
實驗材料 菌源:土樣10g;
培養基 牛肉膏蛋白腖培養基;
實驗儀器與用具
1)超淨工作台、恒溫培養箱、酒精燈
2）1000ul及100ul移液槍、1000ul及100ul槍頭、無菌1.5ml的離心管、離心管架
3）無菌平皿、塗布棒、接種環
實驗試劑:無菌水;
實驗內容
1、采土樣:
選擇肥沃土壤,去表層土,挖5－20cm深度的土壤數10g,裝入已滅菌的牛皮紙袋,封好袋口,帶回實驗室。
2、製備土壤稀釋液：
稱取土樣1.0g，放入盛99ml無菌水的三角瓶中，置搖床振蕩20min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-2）。用100ul移液槍從中吸取100ul土壤懸液，注入事先分裝有900ul無菌水的離心管中，吹吸3次，振蕩均勻（10-3）。然後同樣方法，配置成稀釋度為10-4，10-5的土壤菌懸液。
3、分離
1）塗布法
用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白腖培養基平板上，用灼燒冷卻後的無菌玻璃塗棒塗勻。每個濃度做3個平板（重複）。
2）傾注法
用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的空白無菌平皿中，然後在各平皿中加入已經融化並冷卻到45 -50℃的牛肉膏蛋白腖培養基（已滅菌）12-15ml，將培養皿在超淨工作台麵上輕輕轉動，使稀釋的菌懸液與融化的培養基混合均勻，直至培養基凝固。
注意：無菌操作；用槍頭吸取菌懸液時注意“吹打數次”確保混勻。
4、培養
待平板上液體被完全吸收，將平板倒置於370C溫箱中培養24h；
5、菌落計數
含菌樣品的微生物經稀釋分離培養後，每一個活菌細胞可在平板上繁殖形成一個肉眼可見的菌落，故可據平板上菌落的數目推算出每克含菌樣品中所含的活菌總數（菌落形成數目）。
每克含菌樣品中微生物的活細胞數（菌落形成數，CFU＝
（同一稀釋度平板上菌落平均數× 10×稀釋倍數）/含菌樣品克數
菌落計數規則：
選擇平均菌落數在30~300間的平板
（1）隻有一個稀釋度符合，以該稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；
（2）有兩個稀釋度符合，取決於二者比值（高稀釋度的菌落數除以低稀釋度的菌落數的值）：
a)若0.5≤比值≤2，以兩稀釋度的菌落數乘稀釋倍數所得的值的均值報告。
b)若2≤比值或比值≤ 0.5，則取其中較少的菌落總數進行報告。
（3）若所有稀釋度的菌落平均數均大於300，則按稀釋倍數最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；
（4）若所有稀釋度的菌落平均數均小於30，則按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；
所有菌落數均不在30~300間
以最接近30或300的平均菌落數乘稀釋倍數
6、斜麵接種
選擇分離效果較好，認為已經純化的單菌落，挑選一個，用接種環接種斜麵。貼好標簽。
7、培養
置370C恒溫箱中培養24h，置冰箱保藏。
結果與討論
計算含菌樣品中的所含活菌總數
在恒溫箱中培養微生物時為何要倒置？
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