投射電子顯微鏡的觀察樣品的主要製備方法是:
1、投影法
在真空條件下,用電子散射能力強的重金屬原子來噴鍍樣品表麵,這樣在樣品和沒有噴鍍的區域形成了較強的反差,而沒有噴鍍的部分成了樣品的投影,根據投影我們可以了解樣品的立體形狀、高度,通常用這種方法來觀察細菌的鞭毛或病毒的顆粒。
2、負染法
因為這種方法是將樣品的背景染色以突顯樣品,所以稱為負染。一般是用電子密度高,本身不會顯示任何結構,又和樣品不起反應的物質,例如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍,同時染色劑還會投入觀察對象的內部,這樣,既能顯示外形,又可在一定程度上反應樣品的內部結構。用這種方法可以觀察細菌細胞、病毒等。
3、超薄切片法
這是最常用的方法,因為可以觀察細胞或其它樣品內部的細微結構。通常是要按照一定程序對樣品進行固定,脫水,然後包埋在樹脂中作為支持物,用超薄切片機切成極薄的切片。因為隻有在20~100納米厚度的切片用投射電子顯微鏡才能觀察,所以一般細菌樣品,一個細胞要分割成10片到50片。
4、冰凍蝕刻法
所謂冰凍蝕刻,是把樣品放在-196℃的液態氮中迅速冷凍,然後加溫到-100℃,使樣品變得非常脆弱易碎,再用預先也冷卻到-196℃的非常鋒利的玻璃斷口切割經冷凍的樣品,這樣使樣品在最容易斷裂的部位斷開(如果是微生物細胞,則多半是沿內膜中部),然後讓樣品放在真空條件下升華掉斷口處的冰,最後用重金屬噴鍍該斷口表麵,即可用電子顯微鏡觀察其結構。用這種製備方法的優點是可以避免在固定、脫水和包埋過程中造成細胞結構的人為改變而形成的假象。
和投射電子顯微鏡是靠透過物體的電子成像不同,掃描電子顯微鏡的成像是靠觀察物體表麵發射的電子。掃描電子顯微鏡是用聚焦得很細的電子束在樣品表麵掃描。電子激發樣品表麵的原子放電,釋放出微細的電子簇(二次電子),用靈敏的檢測裝置可以捕獲它們,然後通過類似電視機的原理將樣品圖象呈現出來。二次電子對檢測器的作用取決於樣品表麵的性質,當電子激發樣品表麵突起部位時,會有大量二次電子進入檢測器,而表麵凹陷處則隻有少量二次電子進入,所以可以顯出反差突出、明暗清晰的三維圖象。而且它的成像焦深較長,圖象的立體感強,和肉眼所見差別不大。製備掃描電子顯微鏡的樣品也先要經過固定、脫水等處理,以免在真空條件下變形失真,為了獲得較多的二次電子,表麵要噴塗重金屬和碳原子。
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