因為在接近中性的環境中細菌都帶有負電荷，易與帶正電荷的堿性染料結合，故常用堿性苯胺染料如美藍、結晶紫、堿性複紅等染色細菌。
（一）常用染料
1.堿性染料：電離後顯色離子帶正電荷，易與帶負電荷的被染物結合。由於細菌的等電點在pH2～5之間，在堿性、中性、弱酸性的環境中細菌均帶負電荷，易與帶正電荷的染料結合而著色。常用的染料有堿性複紅、結晶紫、美藍等。
2.酸性染料：電離後顯色離子帶負電荷，易與帶正電荷的被染物結合。一般情況下細菌都帶有負電荷故不易著色。如果降低菌液的pH使細菌帶正電荷，則可被染色。酸性染料通常用來染細胞漿，而很少用於細菌的染色。常用的酸性染料有伊紅、剛果紅等。
3.複合染料（中性染料）及熒光染料：複合染料是堿性染料和酸性染料的複合物，如瑞氏染料（伊紅美藍）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料如熒光標記的抗體，熒光素常用異硫氫基熒光素。這些染色常用於某些特殊的染色技術中。
（二）常用的染色方法
細菌染色的基本程序：塗片（幹燥）→固定→染色（初染→媒染→脫色→複染）。
1.單染色法：用一種染料將細菌和周圍物體染成同一種顏色。細菌經單染色法處理後，可觀察其形態、排列、大小及簡單的結構，但不能顯示各種細菌染色性的差異。
2.複染色法：用兩種或兩種以上的染料染色的方法，稱為複染色法或鑒別染色法。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。
（1）革蘭染色：本法是細菌學中最經典、最常用的染色方法。除糞便、血液等極少數標本外，絕大多數標本在分離培養之前都要進行革蘭染色、鏡檢。
意義：①鑒別細菌：通過革蘭染色將所有細菌分為G+菌和G-菌兩大類，可初步識別細菌，縮小範圍，有助於進一步鑒定。甚至有時結合細菌特殊形態結構及排列方式，對病原菌可進行初步鑒定。②選擇藥物參考：G+菌與G-菌對一些抗生素表現出不同的敏感性。③與致病性有關： 大多G+菌的致病物質是外毒素，而G-菌大多能產生內毒素，兩種致病作用不同。
（2）抗酸染色：抗酸染色也可將細菌分為兩大類：即抗酸性細菌和非抗酸性細菌。因為臨床上絕大多數病原菌為非抗酸性細菌，所以抗酸染色不作為臨床上常規的細菌檢查項目，隻針對性用於結核病、麻風病等的細菌檢查。疑似結核分枝杆菌感染的標本，經抗酸染色後以油鏡檢查，即可作出初步鑒定。若查見紅色抗酸杆菌，可報告為“找到抗酸分枝杆菌”。對臨床疾病的診斷和治療具有重要參考價值。
3.熒光染色：熒光染色法敏感性強，效率高而且容易觀察結果，在臨床細菌鑒定中有很大的實用價值。主要用於結核分枝杆菌、麻風分枝杆菌、白喉棒狀杆菌及痢疾誌賀菌等的檢測。如痰標本塗片、固定，用熒光染料金胺O法（也稱金胺O-羅丹明B法）染色，以熒光顯微鏡檢查，在暗背景中可觀察到呈金黃色熒光的菌球。
除以上所述染色方法外，用於細菌鑒定的還有鞭毛染色、異染顆粒染色等。
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