朊病毒的檢測（下）
錄入時間:2012-7-16 8:50:48
來源：百度文庫
3 借助特殊儀器的檢測方法
(1)電鏡法：電鏡檢測瘙癢病相關纖維(SAF)是朊病毒檢測的另外一種方法。現在認為PrPsc是SAF的組成成分。瘙癢病相關纖維為杆狀、纖維狀結構，其實是PrPsc在用去垢劑提取過程中，不同提取條件下形成的產物，感染生物體的組織切片中尚未發現SAF。基本步驟是：將被檢組織置於10％N-laruoylsarcosine溶液中勻漿，差速離心、PK消化，重懸於蒸餾水中，負染，電鏡觀察。鏡下可見兩種瘙癢病特有的大分子纖維。電鏡檢查SAF靈敏度較低，不如免疫印跡方法。
(2)毛細管SDS-凝膠電泳：該法主要是通過理化方法--差速、超速離心，sodium N-lauroylsarcosine、PK處理，提純PrPsc，然後在 Beckman P/ACE 5 500上進行毛細管SDS-凝膠電泳。根據各組分通過檢測器時，在214 nm波長處產生吸收峰的時間和峰形，鑒別出瘙癢病病原因子PrPsc。該法標本用量少，無需免疫學試劑，判斷直觀；缺點是需用超速離心機、專用毛細管電泳儀。
(3)熒光標記肽鏈的毛細管電泳免疫測定法：該法是根據免疫競爭原理測定，采用無區帶毛細管電泳技術結合免疫熒光技術，檢測標本中微量的PrPse。其基本原理是將人工合成PrPsc特異性肽鏈(142～154)標記上熒光，然後與一定量的特異性抗體、羊腦提取物一起電泳，熒光標記的肽鏈與抗體結合後，遷移率發生改變，從而與遊離的標記肽鏈分離開來，由於抗體的量隻能結合大約50％的標記肽鏈，因而熒光標記的結合型肽鏈與遊離型標記肽鏈的比例是固定的。當羊腦提取物中存在微量的PrPsc，由於其與標記肽鏈競爭結合抗體，導致結合型肽鏈與遊離型肽鏈的比例發生改變，從而被儀器檢測出來。該方法靈敏度很高，能檢測到135 pg的PrPsc，可用於檢測朊病毒水平很低的腦外組織(如血液等)。
(4)雙色強熒光目標掃描法：該法是運用共聚焦雙色熒光相關分光鏡技術檢測極其微量的朊病毒。其基本原理是利用致病性 PrPres，在適當條件下自我複製和自發聚集的特點，將重組PrP(rPrP)標記上綠色熒光，PrPres與正常構象的rPrP結合後，通過變構複製出大量的異常構象的rPrP蓋。由於PrPres在一定條件下可自發聚集，從而使PrPres周圍聚集了大量的rPrP蓋，使其熒光強度超過遊離的rPrP50倍。同時為了增強實驗的特異性，又加入了標記上紅色熒光的特異性單抗，使PrPres- rPrP蓋聚集體又標記上紅色熒光。隻有同時發出高強度紅、綠熒光的顆粒，才能被檢測儀器判為PrPres。
目前，朊病毒領域的許多方麵對人類來說還有一片空白或知之甚少，如朊病毒突破種屬屏障傳播的程度，通過生物製品和臨床醫療傳播的危險性，其他傳播途徑的探知，以及朊病毒致病機製的研究等等，諸多方麵的問題都離不開朊病毒的檢測，朊病毒檢測方法的發展必將為朊病毒的研究開辟廣泛的前景。
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