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噬菌體的分離



錄入時間:2013-7-19 9:22:51 來源:betway必威西汉姆联生物

噬菌體廣泛分布於自然界中,凡有細菌存在的地方,就有可能有其相應的噬菌體出現,那末就可能從海水、淡水和汙水中,甚至是海泥或海產品中分離到噬菌體.

1 .水中噬菌體的分離

常用的方法有濾菌器過濾法和加熱法兩種。

1)過濾法:

取水樣300 毫升.加到100 毫升四倍濃度肉湯蛋白腖培養基內,再加入要分離的噬菌體的相應幼齡(如腸道細菌,經6-8 小時培養)菌液3-4 毫升。在37孵育18-24 小時後,以每分鍾2000轉速離正沉澱30 分鍾.上清液經賽氏濾菌器過濾,濾液鑒定.

2)加熱法:

由於使用濾菌器過濾,常能吸附一部分噬菌體.若液體內噬菌體數量不多時,較難分離成功。而加熱法是根據噬菌體的耐熱性較一般無芽胞細菌高,故用較高的溫度將大部分細菌殺死,噬菌體仍保存著,經過多次反複,使液體中的噬菌體數量增多.最後經過濾器的液體則含有眾多的噬菌體。

分離過程如下:將5-10 毫升汙水加至10-20加毫升肉湯內,混合後加熱56 小時或60半小時,取出離心(每分鍾1500轉)沉澱10 分鍾。取上清液2-4 毫升加於5-10 毫升肉湯培養基中,再加幼齡的相應菌液0.5毫升,在37 培養18-20 小時,重新加溫,離心沉澱,取上清液加於肉湯中,加菌液、培養。如此反複3-4 次,最後經賽氏濾菌器過濾,濾液供鑒定。

2 .噬菌體的鑒定

將已知菌密密地塗布於肉湯蛋白腖瓊脂平板表麵上,取待測的噬菌體液滴於平板上,每板分成三等分,每份1 滴.在37 下培養24小時後.檢查有無透明菌斑出現,以說明濾液中是否含有已知菌的相應噬菌體.

3 .從貝類中分離純化噬菌體

現已知有100多種病毒可從人或動物腸道,或其他分泌物中排泄出來.而汙染水源,而貝類動物及其他功物能聚集人類致病性病毒.不少學者報道在海水、海洋浮遊生物、海產貝類和汙水中發現,並分離出病毒。Moson Moclean( 1962 )證實了生牡蠣妨內存在著肝炎病毒。由於噬菌體對宿主有高度的特異性.則可利用其宿主作為敏感菌株去培養和發現它們,並根據其對宿主細胞的裂解,可在含有敏感菌株的平板培養基上出現可見的噬菌斑,且一個噬菌體產生一個噬菌斑,一種純的噬菌體具有相同形態大小的噬菌斑,故可將某種樣品中的噬菌體分離與純化。

1)貝類樣品的處理:取三個活牡蜘,用自來水洗刷貝殼表麵,洗淨後用無菌水洗三次。放於鋪有經高壓消毒的四層紗布的解剖盤上.取無菌解刻刀解剖其肉,無汙染地研磨成漿,加無菌水100 毫升經離心(2000轉/分25分鍾)去沉澱。

2)增殖培養:取前步驟的上清液,全部加雙倍濃度肉湯蛋白腖培養基100 毫升及所要分離的噬菌體的幼齡宿主,如大腸杆菌、痢疾杆菌或葡萄球菌等懸浮液2 毫升,於37下培養12-24 小時。

3)噬菌體裂解液的製備:

將增殖培養液以2500 轉/分離心15 分鍾,取上清液經蔡氏濾器過濾,並將濾液倒入另一個無菌的三角瓶中,置37 下培養過夜.以作無菌檢查.

4)噬菌體的檢驗:上述濾液若無菌生長,可作有無噬菌體存在的檢驗,其方法如下:

① 將宿主菌懸液塗布接種於肉湯瓊脂平板培養基上。

② 待平板麵菌液幹後,按三等分各滴上1 小滴無菌濾液於平板上。將平板置於37 培養過夜,如果濾液內有相應宿主的噬菌體存在,則加濾液處便無宿主菌生長,而呈蠶食狀的空斑,即噬菌斑,這證明了噬菌體存在。

③ 如已證明有噬菌體存在,可再將濾液接種於已同時接種有宿主菌的肉湯培養基內,如此重複移種數次,即可使噬菌體增多。

4.純化培養

1)將含有噬菌體的濾液用肉湯液體培養基,按10倍稀釋法稀釋成10-1-10-55 個稀釋度。

2)向裝有4 毫升已融化的,保溫在50左右水浴箱中的瓊脂管加0.1毫升宿主杆菌液,並對號加入0.1毫升各稀釋度的濾液,搖勻。然後,對號傾入直徑為9厘米的裝有10 毫升已凝固的底層瓊脂平皿上.

3)待倒入的上層瓊脂凝固後.置於37培養18-24 時。

4)待出現噬菌斑後,用接種針在選定的噬菌斑刺一下,接種於含有宿主菌的肉湯培養液中,於37 培養18-24 小時,再依上述方法稀釋.倒平板分離,直到平板上出現的噬菌斑形態大小一致.則表明已獲得純化的,相應於宿主菌的噬菌體。

 

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