將待存菌分純後，用準備好的保護劑牛奶洗下菌苔，把菌懸液滴入菌種管後，在管口抽取少許棉花塞入管內細頸處，放入冰箱－40℃速凍40min，放入準備好的混有鹽的冰中，接上真空泵，真空抽幹呈粉末狀，火焰封口醫學教育|網搜集整理，貼上標簽，保存於－40℃冰箱。此法保存時間長，可達15年，不易變性，但需要專用儀器，一般實驗室難以配備，而且過程複雜，操作難度大，需要較長時間才能完成。所以此方法適合具有條件的實驗室菌種的長期保存。
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