神經幹細胞的培養

一、  神經幹細胞的分離

無菌條件下取新生SD大鼠（出生48h內）腦組織，D-Hanks液充分漂洗後，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準確分離海馬，用眼科剪將海馬剪碎後，再轉移到DMEM/F12（1:1）加B27 和bFGF（20ng/ml）的無血清培養基，吸管吹打機械分離製作單細胞懸液，台盼藍染色後細胞計數，調整細胞濃度為5×104~5個/ml，置於24孔培養板中培養，每孔加入細胞懸液500μl。待神經球形成後再次機械分離克隆製作單細胞懸液，仍以5×104個/ml的細胞濃度置於24孔培養板中培養，每孔加入細胞懸液500μl。此後每7d機械分離克隆傳代1次，方法同前。

 

二、BrdU標記

將BrdU溶於無血清培養基，過濾除菌後加入神經球形成後再次機械分離克隆製作的單細胞懸液中（BrdU終濃度為5μmol/L），培養7d待新的神經球形成後，將神經球轉移到預先塗布有多聚賴氨酸的培養板中，貼壁2h行BrdU免疫細胞化學染色。

 

三、  神經幹細胞的誘導分化

選取部分上述傳代後形成的次代神經球種植於預先塗布有多聚賴氨酸的24孔培養板中，並加入有血清培養基（含10％胎牛血清的DMEM/F12），一部分神經球於貼壁2h後行Nestin免疫細胞化學染色，另一部分神經球繼續培養，觀察其生長分化情況。另將一部分次代神經球機械分離製成單細胞懸液後加入有血清培養基貼壁培養，7d後分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細胞化學染色。

 

四、  條件培養液的製備

取1g雞胚的後肢骨骼肌組織，加入9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心獲得上清液，過濾除菌後，加兩倍體積DMEM/F12培養基製成條件培養液備用。

 

五、  神經幹細胞的定向誘導分化

將一部分次代神經球機械分離製成單細胞懸液後分別加入條件培養液和有血清培養基（含10％胎牛血清的DMEM/F12）中對照貼壁培養，7d後均行ChAT免疫細胞化學染色。

 

六、  免疫細胞化學染色

培養細胞用4％多聚甲醛固定30min後，PBS充分漂洗，然後按ABC法分別行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫細胞化學染色，用DAB和H2O2作為呈色劑，陽性著色為棕黃色。具體方法為：

（1） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（2） 0.3%H2O2/0.05M PBS室溫 30min

（3） 0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 ℃，15min

（4） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（5） 5%羊血清/0.05M PBS 37 ℃，15min

（6） I抗（2%羊血清/0.05M PBS配） 4℃，48h

（7） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（8） II抗（2%羊血清/0.05M PBS配，1：200） 37 ℃，1.5h

（9） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（10） AB複合物（0.05M PBS配，1：100） 37 ℃，1.5h

（11） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（12） Tris-HCl緩衝液 37 ℃，15min

（13） DAB顯色 20min

（14） 蒸餾水漂洗 10min×3次

 

然後，為進一步證明實驗組的細胞是膽堿能神經元，將已作完ChAT免疫細胞化學染色的細胞用PBS終止顯色以及進一步封閉非特異性結合位點後， 仍用ABC法行Tuj1免疫細胞化學染色，用含有NiCl的DAB和H2O2作為呈色劑,雙標陽性細胞著色為藍黑色。