1.塗片：(1)在潔淨無油脂的載玻片上滴一滴生理鹽水(如果是液體菌懸液,則可不滴)。(2)用滅菌接種環挑取菌落少許至載玻片的生理鹽水內,並輕輕塗布成薄薄的菌膜。若是菌液標本,則用無菌接種針直接塗布成菌膜。 2.幹燥：塗布的標本,一般在室溫下自然幹燥。
• 若需加速幹燥，則可在酒精燈火焰上方利用其熱空氣加溫,切忌火烤和溫度過高。
3.固定：細菌固定常用的是火焰加熱法
• 將幹燥塗片迅速通過火焰2~3次,溫度不宜過高,以玻片背麵觸及皮膚有熱感而不燙手為度。
4.染色：染色的目的是增大標本與環境的反差，便於在顯微鏡下觀察。
• 以普通塗片標本的染色為例,就是將所需染色液滴加在標本上，以覆蓋塗膜為夠，達到所需染色時間，傾去染色液，水洗，吸幹即可。
5.媒染：有的染色還需要增加媒染劑。以增大染料與被檢標本物質的親和力，或使染料更好地固定於被染標本。
• 媒染劑可用於細菌標本固定之後，也可包含在固定劑或染色液中，革蘭氏染色中的碘液就是媒染劑。
6.脫色：使著色的染料脫去顏色稱為脫色。能脫色的物質稱為脫色劑。
• 在染色中,使用脫色劑的作用有的是起溶媒作用,有的是影響細菌蛋白質的電離度，改變電荷的性質和數量，因而影響染料的染色質量。
• 利用脫色劑主要是檢查染料與細菌結合的穩定程度，作為鑒定染色之用。如革蘭氏染色使用乙醇，就是鑒別不同的細菌。
• 使用脫色劑時，就是將脫色劑滴在經過染色的標本上，作用一定時間後，傾去脫色劑，水洗即成。有的脫色一定要掌握好時間，否則不能達到理想目的。
7.複染：在進行鑒別染色時,已經進行過脫色的標本，常需要複染劑重複染色1次，使複染劑與初染顏色形成鮮明對比。複染不宜太強，以免覆蓋初染顏色。
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