6.1生產商及實驗室自製培養基和試劑的質量控製的測試方法
6.1.1非選擇性分離和計數固體培養基的目標菌生長率定量測試方法
6.1.1.1平板的製備與保存
傾注融化的培養基到平皿中，使之在平皿中形成一個至少3 mm厚的瓊脂層（直徑90 mm的平皿通 常要加入18 mL〜20 mL瓊脂培養基），需添加試劑的培養基，應使培養基冷卻至47℃~50℃後才添 加試劑。傾注後將平板放到水平平麵，使瓊脂冷卻凝固。凝固後的培養基應立即使用或存放於暗處和(或) 2℃~8℃冰箱的密封袋中，在有效期內使用。使用前應對瓊脂表麵進行幹燥，但應注意不要過度幹燥。
6.1.1.2工作菌懸液的製備
將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯培養過夜或采用其他方法，製備10倍係列稀釋的菌懸液。生 長率測試常用每平板的接種水平為20 CFU~200 cfu
6.1.1.3 接種
選擇合適稀釋度的工作菌懸液0.1 mL，均勻塗布接種於待測平板和參比平板。每一稀釋度接種兩 個平板。可使用螺旋平板法(見附錄F)或傾注法進行接種，並按標準規定的培養條件培養平板。
6.1.1.4 計算
選擇菌落數適中的平板進行計數，按下列式（1)計算生長率。
PR=NS/NO
式中：
PR—生長率；
NS—待測培養基平板上得到的菌落總數；
NO—參比培養基平板上獲得的菌落總數（該菌落總數應2100CFU)
參比培養基的選擇：一般細菌采用TSA，一般黴菌和酵母采用沙氏葡萄糖瓊脂，對營養有特殊要 求的微生物采用適合其生長的不含抑菌劑或抗生素的培養基。
6.1.1.5結果解釋
目標菌在培養基上應呈現典型的生長。非選擇性分離和計數固體培養基上目標菌的生長率應不小 於0.7
6.1.2 選擇性分離和計數固體培養基的測試方法
6.1.2.1目標菌生長率定量測試方法
6.1.2.1.1平板的製備與保存
按照6.1.1.1中要求進行。
6.1.2.1.2工作菌懸液的製備
按照 6.1.1.2中要求進行。
6.1.2.1.3 接種
按照6.1.1.3中要求進行。
6.1.2.1.4 計算
按照6.1.1.4中要求進行。
6.1.2.1.5 結果解釋
目標菌在培養基上應呈現典型的生長。選擇性分離固體培養基上目標菌的生長率一般不小於0.5， 最低應為0.1；選擇性計數固體培養基上目標菌的生長率一般不小於0.7。
6.1.2.2非目標菌(選擇性)半定量測試方法
6.1.2.2.1平板的製備與保存
按照6.1.1.1中要求進行。
6.1.2.2.2工作菌懸液的製備
將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯培養過夜作為工作菌懸液。
6.1.2.2.3 接種
用1 μL接種環取選擇性測試工作菌懸液1環，在待測培養基表麵劃六條平行直線（如圖1)，同時 接種兩個平板，劃線時可在培養基下麵放一個模板圖，按標準規定的培養條件培養平板。
操作時用接種環而不用接種針，接種環應完全浸入培養基中。取一滿環接種物，將接種環接觸容 器邊緣3次可去除多餘的液體。劃線時，接種環與瓊脂平麵的角度應為20°〜30°。接種環壓在瓊脂表 麵的壓力和劃線速度前後一致，整個劃線應快速連續，移取液體培養物時應將接種環伸入培養液下部 分以防止環上產生氣泡或泡沫。
圖1非目標、菌半定量劃線法接種模式圖
6.1.2.2.4 計算
培養後按以下方法對培養基計算生長指數G每條有比較稠密菌落生長的劃線則G為1，每個培養 皿上最多為6分。如果僅一半的線有稠密菌落生長，則G為0.5。如果劃線上沒有菌落生長、生長量少於 劃線的一半或菌落生長微弱，則G為0記錄每個平板的得分總和便得到G。同時接種兩個平板。
6.1.2.2.5 結果解釋
非目標菌的生長指數G—般小於或等於1，至少應達到小於5
6.1.2.3非目標菌(特異性)定性測試方法
6.1.2.3.1平板的製備與保存
按照6.1.1.1中要求進行。
6.1.2.3.2 工作菌懸液的製備
6.1.2.3.3 按照6.1.1.2中要求進行。
6.1.2.3.4 接種
用1 μL接種環取測試菌培養物在測試培養基表麵劃平行直線。並按標準規定的培養條件培養平板。
6.1.2.3.5 結果解釋
非目標菌應有典型的菌落外觀、大小和形態。 6.1.3非選擇性增菌培養基的半定量測試方法 6.1.3.1培養基的製備
將培養基分裝試管，每管10 mL
6.1.3.2 工作菌懸液的製備
將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯培養過夜或采用其他製備方法，製備10倍係列稀釋的菌懸液。
6.1.3.2 接種
在裝有待測培養基的試管中接種10 CFU〜100 CFU的目標菌，每管接種量為1 mL，接種兩個平行 管。同時將1 mL菌懸液（與試管接種同一稀釋度）傾注平板，接種兩個平板，作接種量計數用。按標 準方法中規定的培養時間和溫度進行培養（如增菌時間為8 h以下，需取10 μL培養後的增菌液傾注到 適合的培養基中，再按適合的培養時間和溫度進行培養）。
6.1.3.3 結果解釋
用目測的濁度值（如0〜2)評估培養基：
——0表示無混濁；
—1表示很輕微的混濁；
——2表示嚴重的混濁。
目標菌的濁度值應為2
有時可以觀察到微生物生長後聚集成細胞團，沉積在試管或瓶子底部，發生這種情況時，小心振 蕩試管後再進行觀察。
如增菌8 h以下，10 μL增菌液培養計數結果參照附錄D培養基質量控製標準。
6.1.4選擇性增菌培養基的半定量測試方法
6.1.4.1培養基的製備
將培養基分裝試管，每管10 mL
6.1.4.2 工作菌懸液的製備
按照6.1.3.2中要求進行。
6.1.4.3 接種
6.1.4.3.1混合菌的接種
在裝有待測培養基的試管中接種10 CFU〜100 CFU的目標菌（特殊接菌量參照附錄D培養基質 量控製標準），並接種1000 CFU〜5000 CFU的非目標菌，接種總量為1 mL，同時接種兩個平行管， 混勻。同時分別將目標菌菌懸液（與試管接種同一稀釋度）和非目標菌菌懸液（比試管接種小10〜100 倍稀釋度）1mL傾注平板，接種兩個平板，作接種量計數用。按標準方法中規定的培養時間和溫度進 行培養。
6.1.4.3.2非目標菌的接種
在裝有待測培養基的試管中接種1000 CFU〜5000 CFU的非目標菌，接種量為1 mL，同時接種兩 個平行管，混勻。按標準方法中規定的培養時間和溫度進行培養。
6.1.4.4 培養液的接種
6.1.4.4.1 混合菌培養液的接種
用10 μL接種環取1環經培養後的混合菌培養液，劃線接種到特定的選擇性平板上，同時每管接 種一個平板。按標準方法中規定的培養時間和溫度進行培養。
6.1.4. 4.2非目標菌培養液的接種
吸取10 μL經培養後的非目標菌培養液，均勻塗布接種到非選擇性平板（如TSA)上。同時每管 接種一個平板。可使用傾注法進行接種，並按標準規定的培養條件培養平板。
6.1.4.5 計算和結果解釋
目標菌在選擇性平板上的菌落應>10 CFU，則表示待測液體培養基的生長率良好；非目標菌在非 選擇性平板上的菌落數應<100 CFU，則表示待測液體培養基的選擇性為良好。
6.1.5選擇性液體計數培養基的半定量測試方法
6.1.5.1培養基的製備
將培養基分裝試管，每管10 mL
6.1.5.2 工作菌懸液的製備
按照6.1.3.2中要求進行。
6.1.5.2 接種
6.1.5.3 6.1.5.3.1目標菌的接種
在裝有待測培養基的試管中接種10 CFU〜100 CFU的目標菌，接種總量為1 mL，同時接種兩個 平行管，混勻。同時將1 mL菌懸液(與試管接種同一稀釋度))傾注平板，接種兩個平板，作接種量計數 用。按標準方法中規定的培養時間和溫度進行培養。
6.1.5.3.2非目標菌的接種
在裝有待測培養基的試管中接種1000 CFU〜5000 CFU的非目標菌，接種總量為1 mL，同時接種
兩個平行管，混勻。同時將1 mL菌懸液(比試管接種小10〜100倍稀釋度)傾注平板，接種兩個平板， 作接種量計數用。按標準方法中規定的培養時間和溫度進行培養。
6.1.5.4 結果解釋
用目測的濁度值(如0〜2)評估培養基：
——0表示無混濁；
—1表示很輕微的混濁；
——2表示嚴重的混濁。
並記錄小導管收集氣體的體積比。
目標菌的濁度值應為2，產氣應為1/3或以上；非目標菌的濁度值應為0或1，無產氣現象。
注：有時可以觀察到微生物生長後聚集成細胞團，沉積在試管或瓶子底部，發生這種情況時，小心振蕩試管後再 進行觀察。
6.1.6懸浮培養基和運輸培養基的定量測試方法
6.1.6.1培養基的製備
將培養基分裝試管，每管10 mL(有特殊要求的可選用5 mL)
6.1.6.2目標、菌工作菌懸液的製備
按照6.1.3.2中要求進行。
6.1.6.3 接種
在裝有待測培養基的試管中接種100 CFU〜1000 CFU的目標菌，同時接種兩個平行管，混勻後， 立即吸取1 mL待測培養基混合液，參照附錄F培養基質量控製標準選用相應的培養基傾注平板，每管 待測培養基接種一個平板。按標準方法中規定的培養時間和溫度培養後，進行菌落計數。
剩餘已接種菌液的待測培養基置20℃~25℃放置45min後；再吸取1 mL傾注平板，每管培養基接 種一個平板，按標準方法中規定的培養時間和溫度培養後，進行菌落計數。如保存條件有特殊要求的 待測培養基，參照附錄F培養基質量控製標準要求放置或培養後再進行菌落計數。
6.1.6.4結果觀察與解釋
待測培養基中的菌落數變化應在± 50%內。
6.1.7 Mueller-Hinton血瓊脂的紙片擴散測試方法（定性測試方法）
6.1.7.1平板的製備與保存
傾注融化的培養基到平皿中，使之在平皿中形成一個厚度為4 mm〜5 mm的瓊脂層。傾注後將平 板放到水平平麵，使瓊脂冷卻凝固。凝固後的培養基應立即使用或存放於暗處和（或）5 C±3 C冰箱 的密封袋中，在有效期內使用。使用前應可將平板置35 C溫箱中或置室溫層流櫥中對瓊脂表麵進行幹 燥，培養基表麵應濕潤，但不能有水滴，培養皿也不應有水滴。
6.1.7.2質控菌株的複蘇
將質控菌株接種到血平板上，按標準方法中規定的培養時間和溫度進行培養。檢查純度合格後， 用於質控工作菌懸液的製備。
6.1.7.3 質控菌工作菌懸液的製備
將純度滿意的質控菌株培養物懸浮於TSB肉湯中，並調整濁度為0.5麥氏標準（約1x108 CFU/mL〜 2x108CFU/mL)。
6.1.7.4 接種
用塗布法將質控工作菌懸液接種於MH平板上，並貼上相應的抗生素紙片(每平板最多貼6片))，將 平板翻轉後按標準方法中規定的培養時間和溫度進行培養。調整菌懸液濁度與接種所有平板間的時間 間隔不要超過15 min
6.1.7.5結果觀察與解釋
在無反射黑色背景下，觀察有無抑菌環。結果解釋參照參照附錄D表D.7。 6.1.8鑒定培養基的測試方法
6.1.8.1 液體培養基
6.1.8.1.1 培養基的製備
將培養基分裝試管，再進行滅菌和添加試劑。
6.1.8.1.2 工作菌懸液的製備
將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯中或采用其他製備方法，製備成5 McFarland濁度（約109 CFU/mL)的菌懸液。
6.1.8.1.3 接種
吸取0.05 mL〜0.08 mL (約1〜2滴）至待測培養基內，按標準方法中規定的培養時間和溫度進行
培養。
6.1.8.1.4 結果觀察與解釋
需加指示劑的試驗在微生物生長良好的情況下，按順序加入指示劑，再觀察結果。結果解釋參照 附錄D表D.8
6.1.8.2 半固體培養基
6.1.8.2.1培養基的製備
將培養基分裝試管。滅菌後豎立放置，冷卻後備用。
6.1.8.2.2 接種
取新鮮質控菌株斜麵，用接種針挑取菌苔穿刺接種至待測培養基內。按標準方法中規定的培養時 間和溫度進行培養。
6.1.8.2.3 結果觀察與解釋
需加指示劑的試驗在微生物生長良好的情況下，按順序加入指示劑，再觀察結果。結果解釋參照 附錄D表D.8
6.1.8.3高層斜麵培養基和斜麵培養基
6.1.8.3.1 培養基的製備
將培養基分裝試管。滅菌後擺放成高層斜麵（斜麵與底層高度約為2:3)和普通斜麵（斜麵與底層 高度約為3:2)，冷卻後備用。
6.1.8.3.2 接種
高層斜麵培養基：取新鮮質控菌株斜麵，用接種針挑取菌苔穿刺接種至瓊脂高層，穿刺接種完畢 後，再在斜麵上劃“之”字形接種；斜麵培養基：取新鮮質控菌株斜麵，用接種環挑取菌苔在斜麵上 劃“之”字形接種。按標準方法中規定的培養時間和溫度進行培養。
6.1.8.3.3 結果觀察與解釋
需加指示劑的試驗在微生物生長良好的情況下，按順序加入指示劑，再觀察結果。結果解釋參照 附錄D表D.8
6.1.8.4 平板培養基
6.1.8.4.1培養基的製備
傾注滅菌融化的培養基到平皿中，使之在平皿中形成一個至少3 mm厚的瓊脂層（直徑90 mm的平 皿通常要加入18 mL〜20 mL瓊脂培養基）。
6.1.8.4.2 接種
取新鮮質控菌株斜麵，用接種環挑取菌苔在平板上劃“之”字形接種，或用接種針挑取菌苔在平 板上點種接種。按標準方法中規定的培養時間和溫度進行培養。
6.1.8.4.3 結果觀察與解釋
參照附錄D表D.8
6.1.9實驗試劑的測試方法
6.1.9.1實驗方法
按試劑說明書進行。
6.1.9.2 結果觀察與解釋
6.1.9.3 參照附錄D表D.8
