中華人民共和國進出口商品檢驗行業標準
出口食品小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗方法 SN 0174—92 代替ZB X04 003—86
Method for detection of Yersinia enterocciitica in food for export
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1 主題內容與適用範圍
本標準規定了出口冷凍和生鮮的豬肉、豬舌、雞肉、蝦和蝦仁中小腸結腸炎耶爾森
氏菌(以下簡稱耶氏菌)檢驗方法。
本標準適用於出口冷凍和生鮮的豬肉、豬舌、雞肉、蝦和蝦仁中耶氏菌檢驗。其他
食品可參照使用。
2 樣品製備及增菌培養
2.1 如為冷凍食品,應於2～5℃下不超過18h解凍。若不能及時檢驗,應放於—15℃保存,
最多不能超過2 d。非冷凍易腐的食品應置於4℃冰箱保存,最多不得超過3d。
2.2 無菌操作稱取剪碎後的樣品25g(豬舌應剪取舌根、舌兩側及舌尖部肉),置於裝有
225mL改良的磷酸鹽緩衝液的500mL廣口玻璃瓶中,充分振蕩(若采用均質,可將剪碎後的
樣品25g置於滅菌均質杯內,加入25mL已滅菌的改良磷酸鹽緩衝液,以8000～10000r/min
均質0.5min,再將均質好的樣品置入裝有200mL改良的磷酸鹽緩衝液的500mL廣口玻璃瓶
中,充分振蕩),然後於25℃培養48±2h。吸取該培養液1mL移種於預先預熱到25℃的裝有
9mL的5g/L氫氧化鉀溶液的試管中,使之充分混合0.5min。立即吸取該混合液2mL移種於
預先預熱到25℃的裝有8 mL的改良的酵母浸汁-孟加拉紅肉湯的試管中,充分混合,於25
℃培養4～6h。
3 分離培養
3.1 將上述經改良的酵母浸汁-孟加拉紅肉湯增菌的培養液搖勻,以直徑3mm的接種環分
別挑取一環劃線於表麵無凝固水的含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂平板和含吐溫80的麥康凱瓊
脂平板各一個,培養於25℃,含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂平板培養3～4d,含吐溫80的麥康凱
瓊脂平板培養48±2h。
3.2 觀察各瓊脂平板,有無典型或可疑耶氏菌菌落。
耶氏菌的菌落特征見表1：
表1 小腸結腸炎耶爾森氏菌菌落特征
瓊脂平板 菌落類別 菌 落 特 征
大小,mm 表 麵 透明度 高 度 顏 色 邊 緣 形狀
含吐溫80的麥康凱瓊脂 A 1～1.5 粗糙, 有多層環狀皺折 不透明 枕狀,中心呈乳頭狀凸起 淡粉紅色, 菌落周圍繞有毛玻璃樣淡粉紅色暈 不整齊 圓形
B 1～1.5 光滑、濕潤 半透明 扁 平 淡粉紅色, 菌落周圍繞有毛玻璃樣淡粉紅色暈 整 齊 圓形
C 1～3.0 光滑、濕潤 半透明 扁 平 淡橙粉紅色 有細微散射狀皺折 圓形
D 1～1.5 粗糙, 有多層環狀皺折 不透明 枕狀、中心呈乳頭狀凸起 淡粉紅色, 菌落周圍培養基為透明淡薔薇紅色 不整齊 圓形
含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂 E 針尖～ 3.0 光 滑 不透明 扁平或凸起 黑綠色或黑灰色至漆黑色,菌落周圍培養基有時有黑綠色微粒彌漫 整 齊 圓形
F 2～3 粗糙, 有多層環狀皺折 不透明 扁平, 有時中心呈乳頭狀凸起 灰綠色, 菌落周圍繞有淺灰綠色或藍綠色毛玻璃樣暈 不整齊 圓形
4 鑒定
4.1 篩選試驗
4.1.1 每種瓊脂平板至少應挑取兩個典型或可疑菌落,分別用光滑的接種針穿刺並密布
地接種於改良的克氏雙糖鐵瓊脂各一管,於25℃培養24±2h。
4.1.2 挑取菌落後的瓊脂平板,應置於5～8℃至少保留24 h,以備必要時複查。
4.1.3 按表2試驗結果進行判斷。
表2 改良的克氏雙糖鐵瓊脂篩選小腸結腸炎耶爾森氏菌
改良的克氏雙糖鐵瓊脂 初步判斷
斜 麵 底 層 產 氣 硫化氫
A A -(+) - 可疑小腸結腸炎耶爾森氏菌
A A + + 非小腸結腸炎耶爾森氏菌
A A + -
K A + +
K A - -
注：K產堿，A產酸；＋陽性反應；－陰性反應；(＋)偶見少量小氣泡。
4.2 生化試驗
4.2.1 刮取一滿環(直徑3mm)符合表 2的典型或可疑耶氏菌特性的改良克氏雙糖鐵瓊脂
斜麵培養物,接種於裝有1mL Rustigian氏尿素培養基(改良法)的10 mm×100 mm的試管
中,手搖或於電動快速混合器上振搖5～6s,然後於25℃培養,每隔半小時觀察一次,培養觀
察至4h。
4.2.2 將尿素酶試驗陽性的改良克氏雙糖鐵瓊脂斜麵培養物按表3所列生化項目(尿素酶
試驗除外)進行生化試驗,培養於25℃,氨基酸脫羧酶試驗培養24～30h,其他生化試驗陰
性結果的應培養觀察4d。
表3 小腸結腸炎耶爾森氏菌生化反應與血清學試驗結果判定
生 化 反 應 血清學試驗 結果判定
尿素酶試驗 鳥氨酸脫羧酶試驗 賴氨酸脫羧酶試驗 蔗糖試驗 山梨醇試驗 L-阿拉伯糖試驗 鼠李糖試 驗 西蒙氏枸櫞酸鹽試驗
+ + - + + + - - "O"因子血清試驗陽性 小腸結腸炎耶爾森氏菌( 典型 )
+ + - - + + - - "O"因子血清試驗陽性 小腸結腸炎耶爾森氏菌(非典型 )
+ - - - - + - - "O"因子血清試驗陽性
+ + - + + + + + "O"因子血清試驗陽性
+ + - + + + + - "O"因子血清試驗陽性
+ + - + + + - + "O"因子血清試驗陽性
注：＋陽性反應；－陰性反應。
4.2.3 觀察生化反應結果,將符合表3耶氏菌特性的,按4.3進行血清學試驗；如不符合
表3 所列生化反應,特別是尿素酶試驗陰性或賴氨酸脫羧酶試驗陽性為非小腸結腸炎耶
爾森氏菌。
4.3 血清學試驗
在潔淨的載玻片上加一滴“O”因子血清,將待試培養物混入其內,使成為均一性混
濁懸液,將玻片輕輕搖動0.5～1 min,在黑色背景下觀察反應。如在2min內出現比較明顯
的小顆粒狀凝集者,即為陽性反應,反之則為陰性,另用生理鹽水作對照試驗,以檢查有無
自凝現象。
4.4 根據4.2和4.3試驗結果,按照表3進行判定。
如生化反應結果完全符合表3耶氏菌特性,但與所有“O”因子血清均不發生凝集反應
者,其菌落典型,鏡檢為革蘭氏陰性、無芽胞小短杆菌,可按《Bergey氏細菌學鑒定手冊》
最新版擴大必要的生化試驗,判定為可疑小腸結腸炎耶爾森氏菌,並送交上一級單位鑒定。
5 報告結果
5.1 報告陽性結果:“檢出小腸結腸炎耶爾森氏菌”。
5.2 報告陰性結果:“未檢出小腸結腸炎耶爾森氏菌”。
6 培養基
6.1 改良的磷酸鹽緩衝液
磷酸氫二鈉 8.23g
磷酸二氫鈉(含1個結晶水) 1.20g
氯化鈉 5.00g
山梨醇 10.00g
膽鹽(3號) 1.50g
蒸餾水 1000mL
將前三種成分溶於水中,再加入後兩種成分,溶解後調至pH7.6,分裝於500mL廣口玻
璃瓶內,每瓶225mL,高壓滅菌121℃15min。
6.2 改良的酵母浸汁-孟加拉紅肉湯(modified yeast extract-rose bengal broth)
6.2.1 基礎液
磷酸二氫鉀 0.508g
磷酸氫二鈉 11.21g
酵母浸汁 5.00g
氯化鈉 1.00g
硫酸鎂(含7個結晶水) 0.01g
蒸餾水 770mL
將上述各成分溶於蒸餾水中,加熱使之完全溶解,調至pH8.0,121℃高壓滅菌15min。
6.2.2 40 g/L山梨糖水溶液：100.00 mL。
6.2.3 10 g/L丙酮酸鈉水溶液：100.00mL。
6.2.4 4g/L孟加拉紅水溶液：10.00 mL。
6.2.2, 6.2.3溶液流通蒸汽加熱0.5h滅菌,6.2.4溶液過濾除菌,將滅菌過的此三種
溶液加到滅菌、冷卻的基礎液中,調至最終pH為8.0,以無菌操作分裝於18mm×180mm滅菌
的試管中,每管8mL,4℃冰箱保存備用。
6.3 含吐溫80的麥康凱瓊脂
蛋白腖 12.00g
(月示)蛋白腖(proteose peptone) 3.00g
乳糖 10.00g
膽鹽(3號) 1.50g
氯化鈉 5.00g
吐溫80(Tween 80) 10.00g
氯化鈣(無水) 0.20g
中性紅 0.03g
結晶紫 0.001g
瓊脂 18.00g
蒸餾水 1000mL
將瓊脂於800mL蒸餾水中加熱溶化,以50mL蒸餾水將吐溫80稀釋,再將其他各成分(指
示劑除外)加入150mL蒸餾水中,加熱使之完全溶解。將後二種溶液加至已溶化的瓊脂液
中,充分混勻, 調至pH7.1±0.2,再加入指示劑,混勻後121℃高壓滅菌15min,待冷至50～
55℃時,立即傾注於滅菌平皿內,每皿約15 mL,製成的瓊脂平板呈淡橙色。
6.4 含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂
6.4.1 基礎液
牛肉膏 5.00g
蛋白腖 10.00g
葡萄糖 5.00g
氯化鈉 5.00g
吐溫8O(Tween 80) 10.00g
氯化鈣(無水) 0.20g
瓊脂 20.00g
蒸餾水 1000mL
6.4.2 亞硫酸鉍混合液
6.4.2.1 溶解200 g無水亞硫酸鈉於1000 mL蒸餾水中,配成200 g/L水溶液。
6.4.2.2 溶解50 g枸櫞酸鉍銨於500 mL蒸餾水中,配成100g/L水溶液,加1mL濃的氫氧化
銨,放置至澄清,可能還需再加數毫升氫氧化銨。加此溶液於6.4.2.1溶液中並混合之。
6.4.2.3 加100 g無水磷酸氫二鈉並混合之。
6.4.2.4 加10 g枸櫞酸鐵銨於100 mL蒸餾水中,配成100 g/L水溶液。並將此液加入上
述的6.4.2.1、6.4.2.2、6.4.2.3的混合液中。
將混合液於100℃加熱2 min或3 min,用橡皮塞塞瓶,儲存於室溫暗處,不可放於冰箱
內。
6.4.3 加70mL亞硫酸鉍混合液於1000 mL經121℃滅菌15min並冷至70℃左右的基礎液中,
徹底搖勻,再加4 mL 10g/L煌淥水溶液,混勻,待冷至50℃左右時傾注平皿。製成的平板
應為淡乳黃色、不透明,存放於室溫暗處或冰箱內,以臨用前一天製備為宜。
6.5 改良的克氏雙糖鐵瓊脂
牛肉膏 3.00g
酵母膏 3.00g
蛋白腖 15.00g
(月示)蛋白腖 5.00g
山梨醇 20.00g
葡萄糖 1.00g
硫酸亞鐵 0.20g
氯化鈉 5.00g
硫代硫酸鈉 0.30g
酚紅 0.024g
瓊脂 15.00g
蒸餾水 1000mL
以800mL蒸餾水將瓊脂加熱溶化,再用200mL蒸餾水將其他成分(酚紅除外)加熱溶解,
再將以上兩種溶液混勻,調至pH7.4±0.2,然後加入酚紅,分裝於13mm×130mm試管,121℃
高壓滅菌15min,待冷至50℃左右,斜置成深高層斜麵。製成的培養基為淡橙紅色。
培養基采用高層穿刺、斜麵密布劃線接種法。25℃培養24±2h。觀察結果:小腸結腸
炎耶爾森氏菌的反應為底層斜麵均產酸、變黃色、無硫化氫、不產氣(偶有少量小氣泡)。
6.6 Rustigian氏尿素酶試驗培養基(改良法)
6.6.1 基礎成分
酵母浸汁 0.10g
磷酸二氫鉀 0.091g
磷酸氫二鈉(無水) 0.095g
酚紅 0.01g
蒸餾水 900mL
高壓滅菌121℃ 15min
6.6.2 濃尿素液
尿素 20.00g
蒸餾水 100.00g
過濾除菌
6.6.3 將上述兩液混合,分裝於10mm×100mm的滅菌試管中,每管約1 mL左右。製成的培
養基為淡橙黃色,尿素酶反應陽性者培養基由淡橙黃色變為桃紅色,陰性者顏色不變。
6.7 鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶試驗培養基
6.7.1 基礎液
蛋白腖 5.00g
牛肉膏 5.00g
溴甲酚紫(16 g/L) 0.625mL
甲基紅 2.50mL
葡萄糖 0.50g
鹽酸吡哆素(維生素B6,pyridoxine) 0.005g
蒸餾水 1000mL
調至pH6或6.5
6.7.2 基礎液分成三等分,第一部分不加任何氨基酸,分裝試管作對照用；第二部分按
10g/L加入L-賴氨酸雙鹽酸鹽；第三部分按10g/L加入L-鳥氨酸雙鹽酸鹽。若使用DL氨基
酸,應相應地於培養基中按2％濃度加入。加入氨基酸後應再調pH,然後分別分裝於10mm
×100mm試管中,121℃高壓滅菌10 min。
6.7.3 培養基接種後,應加一層液體石蠟(約10mm厚),於25℃培養24～30h。陽性反應者
為紫色或紅紫色,弱陽性者為青灰色,陰性反應為黃色。
6.8 糖發酵培養基
6.8.1 糖發酵肉湯基礎液
蛋白腖 10.00g
牛肉膏 3.00g
氯化鈉 5.00g
Andrade氏指示劑 10.00g
蒸餾水 1000mL
調至pH7.1～7.2
6.8.2 蔗糖、山梨醇最終使用濃度為10g/L,可於滅菌前加入基礎液中,分裝試管,121℃
高壓滅菌10min。L-阿拉伯糖和鼠李糖最終使用濃度為10g/L,應先配成100g/L水溶液,L-
阿拉伯糖水溶液流通蒸汽滅菌30min,鼠李糖水溶液121℃高壓滅菌10min,然後分別以無
菌操作加入先經121℃高壓滅菌15min的基礎液中,無菌操作分裝於已滅菌的13mm×130mm
試管中,每管3mL。
6.8.3 Andrade氏指示劑
蒸餾水 100.0mL
酸性複紅 0.50g
氫氧化鈉(1.0moL/L) 16.00mL
將酸性複紅溶於蒸餾水中,並加入氫氧化鈉,數小時後,如複紅褪色不夠,再加1 mL
或2mL氫氧化鈉溶液,此試劑如保存時間較長則效果更好。
6.8.4 此培養基製成後近於無色,接種後於25℃培養24±2h,陰性反應應繼續培養觀察
4d。陽性反應為紅色,陰性反應則顏色不變。
6.9 西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂
硫酸鎂 0.20g
氯化鈉 5.00g
磷酸二氫按 1.00g
磷酸氫二鉀 1.00g
枸櫞酸鈉 2.00g
瓊脂 20.00g
蒸餾水 1000mL
加1:500溴麝香草酚藍指示劑溶液40mL,混勻,分裝13mm×130mm試管,每管約4mL。
121℃高壓滅菌15 min。斜置試管使成2.5cm高層和4 cm長的斜麵。
製成的培養基為透明、草綠色,接種後於25℃培養24±2h,陰性反應者觀察4d。陽性
反應者斜麵變為藍色,陰性反應則顏色不變。
6.10 5g/L氫氧化鉀溶液
6.10.1 標準溶液
稱取40 g氫氧化鉀,溶於經121℃高壓滅菌30 min的5g/L氯化鈉溶液中,使成400g/L
氫氧化鉀標準溶液,於4 ℃保存備用。
6.10.2 取1mL400g/L氫氧化鉀標準溶液,加入經121℃高壓滅菌30 min的79mL5g/L氯化
鈉水溶液中,分裝於已滅菌的18mm×180mm試管中,每管9mL,此溶液應用前新鮮配製。
6.11 “O”因子血清。
附 錄 A
食品中小腸結腸炎耶爾森氏菌檢驗程序
(補充件)
┏━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 25g 樣品剪碎 (或均質) ┃
┗━━━━━━━┯━━━━━━━┛
↓
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 225mL改良的磷酸鹽緩衝液振蕩25℃, 48±2h ┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
↓ 移入1mL
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 9mL 5g/L氫氧化鉀溶液25℃, 0.5min ┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
↓ 移入2mL
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 8mL改良的酵母浸汁-孟加拉紅肉湯25℃, 4～6h┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
↓
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 含吐溫80的麥康凱瓊脂 含吐溫80的亞硫酸鉍瓊脂 ┃
┃ 25℃, 48±2h 25℃, 3～4d ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━┛
↓
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃改良的雙糖鐵瓊脂25℃, 24±2h ┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
↓
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ Rustigian氏尿素25℃, 4h ┃
┗━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━┛
↓
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 鳥氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶試驗 蔗糖、山梨醇、鼠李糖、阿拉伯糖、 ┃
┃ 25℃, 24～30h 枸櫞酸鹽25℃, 1～4d ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
↓
┏━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 血清學試驗 ┃
┗━━━━━┯━━━━━━━┛
↓
┏━━━━━━━━━┓
┃ 報告結果 ┃
┗━━━━━━━━━┛
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附加說明：
本標準由中華人民共和國國家進出口商品檢驗局提出。
本標準由中華人民共和國天津進出口商品檢驗局起草。
本標準主要起草人齊素瑛、郝士海。
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中華人民共和國國家進出口商品檢驗局1992-12-28批準 1993-05-01實施
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