取供試液10ml（相當於供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理後接種至適量（不少於100ml）的膽鹽乳糖培養基中，培養18～24 小時。取上述培養物，劃線接種於溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基的平板上，培養18～24 小時。
銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表麵濕潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長的菌落與上述菌落形態特征相符或疑似，應挑選2～3 個菌落，分別接種於營養瓊脂培養基斜麵上，培養18～24小時。取斜麵培養物進行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。
氧化酶試驗 取潔淨濾紙片置於平皿內，用無菌玻棒取斜麵培養物塗於濾紙片上，滴加新配製的1％二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30 秒內若培養物呈粉紅色並逐漸變為紫紅色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。
若斜麵培養物為非革蘭陰性無芽孢杆菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。
綠膿菌素（Pyocyanin）試驗 取斜麵培養物接種於PDP 瓊脂培養基斜麵上，培養24 小時，加三氯甲烷3～5ml 至培養管中，攪碎培養基並充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L 鹽酸試液約1ml，振搖後，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP 瓊脂培養基斜麵同法作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。
若上述疑似菌為革蘭陰性杆菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性杆菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應繼續進行適宜的鑒定試驗，確認是否為銅綠假單胞菌。
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