已培養的營養瓊脂斜麵上生長的菌苔，進行生化試驗，即β-半乳
糖苷酶，尿素，賴氨酸脫羧酶，鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗。除宋內氏誌賀氏菌、鮑氏誌賀氏菌13 型的鳥氨酸陽性；宋內氏菌和痢疾誌賀氏菌1 型，鮑氏誌賀氏菌13 型的β-半乳糖苷酶為陽性以外，其餘生化試驗誌賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。另外由於福氏誌賀氏菌6 型的生化特性和痢疾誌賀氏菌或鮑氏誌賀氏菌相似，必要時還需加做靛基質、甘露醇、棉子糖、甘油試驗，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性杆菌。生化反應不符合的菌株，即使能與某種誌賀氏菌分型血清發生凝集，仍不得判定為誌賀氏菌屬。
附加生化實驗
由於某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coil.）、A-D（Alkalescens-Disparbiotypes 堿性-異型）菌的部分生化特征與誌賀氏菌相似，並能與某種誌賀氏菌分型血清發生凝集；因此前麵生化實驗符合誌賀氏菌屬生化特性的培養物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36 ℃培養24 h～48 h)。
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