將待檢樣品選取適宜的2~3個連續稀釋度, 每個稀釋度接種2張測試片。將PetrifilmTM大腸菌群測試片置於平坦實驗台麵，揭開上層膜，用吸管吸取1mL樣液垂直滴加在測試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產生和上層膜直接落下，把壓板（平麵底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋於圓形的培養麵積上，切勿扭轉壓板。拿起壓板，靜置至少1分鍾以使培養基凝固。
將測試片的透明麵朝上置於培養箱內，堆疊片數不超過20片，36℃± 1℃培養24h±2h。
合理稀釋度的選擇，每稀釋度接種2張測試片；
避免氣泡產生；
培養基未凝固時勿挪動。
培養24h ±2h後應立即計數，可目測、用標準菌落計數器、顯微鏡、或 PetrifilmTM自動判讀儀來計數。紅色有氣泡的菌落確認為大腸菌群數。培養圓形麵積邊緣上及邊緣以外的菌落不作計數。當培養區域出現大量氣泡，大量不明顯小菌落或培養區呈暗紅色三種情況，表明大腸菌群的濃度較高，需要進一步稀釋樣品來獲得準確的讀數。
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