培養基和試劑
A.1磷酸鹽緩衝液（PBS）
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A.1.1成分 磷酸二氫鉀 |
34.0 g |
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蒸餾水 |
500.0 mL |
A.1.2製法
貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶於500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000 mL後貯存於冰箱。
稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1000 mL，分裝於適宜容器中，121℃高壓滅菌15 min。
A.2甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂
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A.2.1成分 蛋白腖 |
10.0 g |
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牛肉粉 |
1.0 g |
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D-甘露醇 |
10.0 g |
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氯化鈉 |
10.0 g |
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瓊脂粉 |
12.0～15.0 g |
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0.2 %酚紅溶液 |
13.0 mL |
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50 %卵黃液 |
50.0 mL |
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多黏菌素B |
100,000 IU |
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蒸餾水 |
950.0 mL |
A.2.2製法
將A.2.1前五種成分加入於950mL蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.1，加入酚紅溶液。分裝，每瓶95mL，121℃高壓滅菌15 min。臨用時加熱溶化瓊脂，冷卻至50℃，每瓶加入50%卵黃液5 mL和濃度為10000 IU的多黏菌素B溶液1 mL，混勻後傾注平板。
A.2.2.1 50％卵黃液
取鮮雞蛋，用硬刷將蛋殼徹底洗淨，瀝幹，於70%酒精溶液中浸泡30 min。用無菌操作取出卵黃，加入等量滅菌生理鹽水，混勻後備用。
A.2.2.2多黏菌素B溶液
在50 mL滅菌蒸餾水中溶解500000 IU的無菌硫酸鹽多黏菌素B。
A.3胰酪腖大豆多黏菌素肉湯
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A.3.1成分 胰酪腖（或酪蛋白腖） |
17.0g |
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植物蛋白腖（或大豆蛋白腖） |
3.0 g |
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氯化鈉 |
5.0 g |
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無水磷酸氫二鉀 |
2.5 g |
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葡萄糖 |
2.5 g |
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多黏菌素B |
100 IU/mL |
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蒸餾水 |
1000.0 mL |
A.3.2製法
將A.3.1前五種成分加入於蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃高壓滅菌15 min。臨用時加入多黏菌素B溶液混勻即可。多黏菌素B溶液製法同附錄A.2.2.2。
A.4營養瓊脂
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A.4.1成分 蛋白腖 |
10.0 g |
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牛肉膏 |
5.0 g |
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氯化鈉 |
5.0 g |
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瓊脂粉 |
12.0～15.0 g |
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蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.4.2製法
將A.4.1所述成分溶解於蒸餾水內，校正pH至7.2±0.2，加熱使瓊脂溶化。121℃高壓滅菌15 min，備用。
A.5過氧化氫溶液
A.5.1試劑
3%過氧化氫溶液：臨用時配製，用H2O2配製。
A.5.2試驗方法
用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落,置於潔淨試管內，滴加3%過氧化氫溶液2mL，觀察結果。
A.5.3結果於30s內發生氣泡者為陽性，不發生氣泡者為陰性。
A.6動力培養基
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A.6.1成分 胰酪腖（或酪蛋白腖） |
10.0 g |
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酵母粉 |
2.5 g |
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葡萄糖 |
5.0 g |
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無水磷酸氫二鈉 |
2.5 g |
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瓊脂粉 |
3.0～5.0g |
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蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.6.2製法
將A.6.1所述成分於蒸餾水，校正pH至7.2±0.2，加熱溶解。分裝每管2 mL～3 mL。115℃高壓滅菌20min，備用。
A.6.3試驗方法
用接種針挑取培養物穿刺接種於動力培養基中，30℃±1℃培養48 h±2 h。蠟樣芽胞杆菌應沿穿刺線呈擴散生長，而蕈狀芽胞杆菌常常呈絨毛狀生長，形成蜂巢狀擴散。動力試驗也可用懸滴法檢查。蠟樣芽胞杆菌和蘇雲金芽胞杆菌通常運動極為活潑，而炭疽杆菌則不運動。
A.7硝酸鹽肉湯
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A.7.1成分 蛋白腖 |
5.0 g |
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硝酸鉀 |
0.2 g |
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蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.7.2製法
將A.7.1所述成分溶解於蒸餾水。校正pH至7.4，分裝每管5 mL，121℃高壓滅菌15 min。
A.7.3硝酸鹽還原試劑
甲液：將對氨基苯磺酸0.8 g溶解於2.5 mol/L乙酸溶液100 mL中。
乙液：將甲萘胺0.5 g溶解於2.5 mol/L乙酸溶液100 mL中。
A.7.4試驗方法
接種後在36℃±1℃培養24 h～72 h。加甲液和乙液各1滴，觀察結果，陽性反應立即或數分鍾內顯紅色。如為陰性，可再加入鋅粉少許，如出現紅色，表示硝酸鹽未被還原，為陰性。反之，則表示硝酸鹽已被還原，為陽性。
A.8酪蛋白瓊脂
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A.8.1成分 酪蛋白 |
10.0 g |
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牛肉粉 |
3.0 g |
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無水磷酸氫二鈉 |
2.0 g |
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氯化鈉 |
5.0 g |
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瓊脂粉 |
12.0～15.0 g |
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蒸餾水 |
1 000.0 mL |
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0.4 %溴麝香草酚藍溶液 |
12.5 mL |
A.8.2製法
除溴麝香草酚藍溶液外，將A.8.1所述各成分溶於蒸餾水中加熱溶解（酪蛋白不會溶解）。校正pH至7.4±0.2，加入溴麝香草酚藍溶液，121℃高壓滅菌15 min後傾注平板。
A.8.3試驗方法
用接種環挑取可疑菌落，點種於酪蛋白瓊脂培養基上，36℃±1℃培養48 h±2h，陽性反應菌落周圍培養基應出現澄清透明區(表示產生酪蛋白酶)。陰性反應時應繼續培養72 h再觀察。
A.9硫酸錳營養瓊脂培養基
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A.9.1成分 胰蛋白腖 |
5.0 g |
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葡萄糖 |
5.0 g |
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酵母浸膏 |
5.0 g |
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磷酸氫二鉀 |
4.0 g |
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3.08%硫酸錳（MnSO4·H2O） |
1.0 mL |
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瓊脂粉 |
12.0～15.0 g |
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蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.9.2製法
將A.9.1所述成分溶解於蒸餾水。校正pH至7.2±0.2。121℃高壓滅菌15 min，備用。
A.10 0.5%堿性複紅
A.10.1成分
堿性複紅0.5g
乙醇20.0 mL
蒸餾水80.0 mL
A.10.2製法
取堿性複紅0.5g溶解於20mL乙醇中，再用蒸餾水稀釋至100mL，濾紙過濾後儲存備用。
11動力培養基
A.11.1成分
蛋白腖10.0 g
牛肉浸粉3.0g
瓊脂4.0g
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氯化鈉5.0g蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.11.2製法
將A.11.1所述成分溶解於蒸餾水。校正pH至7.2±0.2，分裝小試管，121℃高壓滅菌15 min，備用。
A.12糖發酵管
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A.12.1成分 牛肉粉 |
5.0 g |
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蛋白腖 |
10.0 g |
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氯化鈉 |
3.0 g |
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磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O） |
2.0 g |
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0.2 %溴麝香草酚藍溶液 |
12.0 mL |
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蒸餾水 |
1 000.0 mL |
12.2製法
A.12.2.1糖發酵管按A.12.1所述成分配好後，校正pH至7.2±0.2，按0.5 %加入葡萄糖，分裝於一個有倒置小管的小試管內，115℃高壓滅菌15 min。
A.12.2.2其他各種糖發酵管可按A.12.1所述成分配好後，分裝每瓶100 mL，115℃高壓滅菌15 min。另將各種糖類分別配好10 %溶液，同時115℃高壓滅菌15 min。將5 mL糖溶液加入於100 mL培養基內，以無菌操作分裝小試管。
注：蔗糖不純，加熱後會自行水解者，應采用過濾法除菌。
A.12.3試驗方法
挑取可疑菌落接種於葡萄糖發酵管中，厭氧條件下36℃±1℃培養24 h±2 h。培養基由紅色變為黃色者表明該菌在厭氧條件下能發酵葡萄糖。
A.13 V-P培養基
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A.13.1成分 磷酸氫二鉀 |
5.0 g |
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蛋白腖 |
7.0 g |
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葡萄糖 |
5.0 g |
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氯化鈉 |
5.0 g |
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蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.13.2製法
將A.13.1所述成分溶解於蒸餾水。校正pH至7.0±0.2，分裝每管1 mL。115℃高壓滅菌20min，備用。
A.13.3試驗方法
用營養瓊脂培養物接種於本培養基中，36℃±1℃培養48 h～72 h。加入6 %α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40 %氫氧化鉀溶液0.2 mL，充分振搖試管，觀察結果，陽性反應立即或於數分鍾內出現紅色。如為陰性，應放在36℃±1℃培養4 h再觀察。
A.14胰酪腖大豆羊血(TSSB)瓊脂
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A.14.1成分 胰酪腖（或酪蛋白腖） |
15.0g |
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植物蛋白腖（或大豆蛋白腖） |
5.0 g |
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氯化鈉 |
5.0 g |
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無水磷酸氫二鉀 |
2.5 g |
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葡萄糖 |
2.5 g |
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瓊脂粉 |
12.0～15.0 g |
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蒸餾水 |
1 000.0 mL |
A.14.2製法
將A.14.1所述各成分於蒸餾水中加熱溶解。校正pH至7.2±0.2，分裝每瓶100 mL。121℃高壓滅菌15 min。水浴中冷卻至45℃～50℃，毎100mL加入5～10mL無菌脫纖維羊血，混勻後傾注平板。
A.15溶菌酶營養肉湯
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A.15.1成分 牛肉粉 |
3.0 g |
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蛋白腖 |
5.0 g |
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蒸餾水 |
990.0 mL |
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0.1%溶菌酶溶液 |
10.0 mL |
A.15.2製法
除溶菌酶溶液外，將A.15.1所述成分溶解於蒸餾水。校正pH至6.8±0.1，分裝每瓶99 mL。121℃高壓滅菌15 min。每瓶加入0.1 %溶菌酶溶液1 mL，混勻後分裝滅菌試管，每管2.5 mL。0.1%溶菌酶溶液配製：在65 mL滅菌的0.1 mol/L鹽酸中加入0.1 g溶菌酶，隔水煮沸20 min溶解後，再用滅菌的0.1 mol/L鹽酸稀釋至100 mL。或者稱取0.1 g溶菌酶溶於100 mL的無菌蒸餾水後，用孔徑為0.45 μm硝酸纖維膜過濾。使用前測試是否無菌。
A.15.3試驗方法
用接種環取純菌懸液一環，接種於溶菌酶肉湯中，36℃±1℃培養24 h。蠟樣芽胞杆菌在本培養基(含0.001％溶菌酶)中能生長。如出現陰性反應，應繼續培養24 h。
A.16西蒙氏檸檬酸鹽培養基
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A.16.1成分 氯化鈉 |
5.0 g |
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硫酸鎂（MgSO4·7 H2O） |
0.2 g |
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磷酸二氫氨 |
1.0 g |
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磷酸氫二鉀 |
1.0 g |
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檸檬酸鈉 |
1.0 g |
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瓊脂粉 |
12.0～15.0 g |
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蒸餾水 |
1000.0 mL |
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0.2 %溴麝香草酚藍溶液 |
40.0 mL |
A.16.2製法
除溴麝香草酚藍溶液和瓊脂外，將A.16.1所述各成分溶解於1000.0 mL蒸餾水內，校正pH至6.8，再加瓊脂，加熱溶化。然後加入溴麝香草酚藍溶液，混合均勻後分裝試管，121℃高壓滅菌15 min。製成斜麵。
A.16.3試驗方法
挑取少量瓊脂培養物接種於西蒙氏檸檬酸培養基，36℃±1℃培養4d。每天觀察結果，陽性者斜麵上有菌落生長，培養基從綠色轉為藍色。
A.17明膠培養基
A.17.1成分
蛋白腖5.0 g
牛肉粉3.0 g
明膠120.0 g
蒸餾水1 000.0 mL
A.17.2製法
將A.17.1所述成分混合，置流動蒸汽滅菌器內，加熱溶解，校正pH至7.4～7.6，過濾。分裝試管，121℃高壓滅菌10 min，備用。
A.17.3試驗方法
挑取可疑菌落接種於明膠培養基，36℃±1℃培養24h±2h，取出，2℃～8℃放置30 min，取出，觀察明膠液化情況。
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