高壓蒸氣滅菌
（一）目的要求
1．了解高壓蒸氣滅菌的基本原理及應用範圍。
2．學習高壓蒸氣滅菌的操作方法。
（二）基本原理
高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然後關閉排氣閥，繼續加熱，此時由於蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點增高，得到高於100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。
在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比幹熱大。其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低（表2—1），二是濕熱的穿透力比幹熱大（表2—2），三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。1g水在100℃時，由氣態變為液態時可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。
表2—1 蛋白質含水量與凝固所需溫度的關係
卵白蛋白含水量/% 30分鍾內凝固所需溫度/℃
50 56
25 74～80
18 80～90
6 145
0 160～170
在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大於水蒸氣的膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低於飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關係見（表2—3）
表2-2 幹熱溫熱穿透力及滅菌效果比較
溫度/℃ 時間/h 透過布層的溫度/℃ 滅菌
20層 10層 100層
幹熱130-140 4 86 72 70.5 不完全
濕熱105.3 3 101 101 101 完全
表2—3 滅菌鍋留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關係
壓力數 全部空氣排出時的溫度/℃ 2/3空氣排出時的溫度/℃ 1/2空氣排出時的溫度/℃ 1/3空氣排出時的溫度/℃ 空氣全不排出時的溫度/℃
Mpa Kg/cm2 Ib/in2
0.03 0.35 5 108.8 100 94 90 72
0.07 0.70 10 115.6 109 105 100 90
0.10 10.5 15 121.3 115 112 109 100
0.14 1.40 20 126.2 121 118 115 109
0.17 1.75 25 130.0 126 124 121 115
0.21 2.10 30 134.6 130 128 126 121
現在法定壓力單位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其換算關係為：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.
一般培養基用0.1Mpa（相當於15 Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6℃滅菌，然後以無菌操作手續加入滅菌的糖溶液。又如盛於試管內的培養基以0.1Mpa,121.5℃滅菌20min即可，而盛於大瓶內的培養基最好以0.1Mpa，122℃滅菌30min。
實驗中常用的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式（圖2-2，A）和手提式（圖2—2，B）二種，其結構和工作原理相同，本實驗以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例，介紹其使用方法，有關自控高壓蒸氣滅菌鍋（autoclave）的使用可參照廠家說明書。
（三）器材
牛肉膏蛋白腖培養基，培養皿(6套一包)，手提式高壓蒸氣滅菌鍋等。
（四）操作步驟
1．首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水麵與三角擱架相平為宜。
切勿忘記加水，同時水量不可過少，以防滅菌鍋燒幹而引起炸裂事故。
2．放回內層鍋，並裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。
3．加蓋，並將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓鬆緊一致，勿使漏氣。
4．用電爐或煤氣加熱，並同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡後，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控製熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用0.1Mpa，121.5℃，20min滅菌。
滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內冷空氣必須完全排盡後，才能關上排氣閥，維持所需壓力。
5．滅菌所需時間到後，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，旋鬆螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。
壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由於內外壓力不平衡而衝出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生汙染，甚至灼傷操作者。
6．將取出的滅菌培養基，需擺斜麵的則擺成斜麵，然後放入37℃溫箱培養24h，經檢查若無雜菌生長，即可待用。
（五）實驗報告
l．結果
檢查培養基滅菌是否徹底。
2．思考題
（1）高壓蒸氣滅菌開始之前，為什麽要將鍋內冷空氣排盡?滅菌完畢後，為什麽待壓力降低“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？
（2）在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，怎樣杜絕一切不安全的因素?
（3）滅菌在微生物實驗操作中有何重要意義?
（4）黑曲黴的孢子與芽孢杆菌的孢子對熱的抗性哪個最強?為什麽?
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