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肉毒毒素方法介紹



錄入時間:2015-1-13 12:10:54 來源:betway必威西汉姆联生物

小鼠生物檢測:是目前唯一被公認的確認肉毒毒素的方法,是檢測肉毒毒素的金標準。

基於免疫化學的檢測方法(A、B、E、F型肉素的檢測):

 ELISA法:用來檢測肉毒毒素已經有20多年了,但是常規ELISA的檢測靈敏度遠遠低於小鼠生物檢測。目前試用的有amp-ELISA、DIG- ELISA,提高了靈敏度,此方法已被用於檢測食物樣品,檢測時間大約需要6h。但是存在型間交叉的問題,陽性樣品仍需小鼠生物檢測法進行確認。

 PCR法:目前還沒有用此方法檢測樣品,原因是其靈敏度非常高,容易受樣品基質的幹擾得至假陽性結果。檢測純水中的毒素隻需3h。

 目前已發表或試用的其它方法:免疫電泳法、放射免疫法、瓊脂凝膠擴散法等。但這些方法的敏感性都不如小鼠生物檢測法高

檢出試驗:

           取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠3隻,每隻0.5mL,觀察4d。注射液中若有肉毒毒素存在,小白鼠一般多在注射後24h內發病、死亡。主要症狀為豎毛,四肢癱軟,呼吸困難,呼吸呈風箱式,腰部凹陷,宛若蜂腰,最終死於呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至症狀不明顯時,則可將注射液做適當稀釋,重做試驗。

確證試驗:

         不論上清液或其胰酶激活處理液,凡能致小鼠發病、死亡者,取樣分成3份進行試驗,1份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清,混勻,37℃作用30min,1份加等量明膠磷酸鹽緩衝液,混勻,煮沸10min;1份加等量明膠磷酸鹽緩衝液,混勻即可,不做其他處理。3份混合液分別注射小白鼠各2隻,每隻0.5mL,觀察4d,若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護存活,而唯有注射未經其他處理的混合液的小白鼠以特有症狀死亡,則可判定檢樣中有肉毒毒素存在,必要時要進行毒力測定及定型試驗。

毒力測定:

          取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液,用明膠磷酸鹽緩衝液做成50倍、500倍及5000倍的稀釋液,分別注射小白鼠各2隻,每隻0.5mL,觀察4d。根據動物死亡情況,計算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力(MLD/mL或MLD/g)。例如:5倍、50倍及500倍稀釋致動物全部死亡,而注射5000倍稀釋液的動物全部存活,則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1000~10000MLD/mL。

定型試驗:

          按毒力測定結果,用明膠磷酸鹽緩衝液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10~1000MLD/mL的範圍,分別與各單型肉毒抗診斷血清等量混勻,37℃作用30min,各注射小鼠2隻,每隻0.5mL,觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩衝液代替診斷血清,與稀釋毒素液等量混合作為對照。能保護動物免於發病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。

注:

1.未經胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結果,則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗。

2.為爭取時間盡快得出結果,毒素檢測的各項試驗也可同時進行。

3.根據具體條件和可能性,定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型。

4.進行確證及定型等中和試驗時,檢樣的稀釋應參照所用肉毒診斷血清的效價。

5.試驗動物的觀察可按陽性結果的出現隨時結束,以縮短觀察時間;唯有出現陰性結果時,應保留充分的觀察時間。

 

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