小鼠生物檢測：是目前唯一被公認的確認肉毒毒素的方法，是檢測肉毒毒素的金標準。
基於免疫化學的檢測方法（A、B、E、F型肉素的檢測）：
ELISA法：用來檢測肉毒毒素已經有20多年了，但是常規ELISA的檢測靈敏度遠遠低於小鼠生物檢測。目前試用的有amp-ELISA、DIG- ELISA，提高了靈敏度，此方法已被用於檢測食物樣品，檢測時間大約需要6h。但是存在型間交叉的問題，陽性樣品仍需小鼠生物檢測法進行確認。
PCR法：目前還沒有用此方法檢測樣品，原因是其靈敏度非常高，容易受樣品基質的幹擾得至假陽性結果。檢測純水中的毒素隻需3h。
目前已發表或試用的其它方法：免疫電泳法、放射免疫法、瓊脂凝膠擴散法等。但這些方法的敏感性都不如小鼠生物檢測法高
檢出試驗：
取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠3隻，每隻0.5mL，觀察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射後24h內發病、死亡。主要症狀為豎毛，四肢癱軟，呼吸困難，呼吸呈風箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死於呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至症狀不明顯時，則可將注射液做適當稀釋，重做試驗。
確證試驗：
不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發病、死亡者，取樣分成3份進行試驗，1份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min，1份加等量明膠磷酸鹽緩衝液，混勻，煮沸10min；1份加等量明膠磷酸鹽緩衝液，混勻即可，不做其他處理。3份混合液分別注射小白鼠各2隻，每隻0.5mL，觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護存活，而唯有注射未經其他處理的混合液的小白鼠以特有症狀死亡，則可判定檢樣中有肉毒毒素存在，必要時要進行毒力測定及定型試驗。
毒力測定：
取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩衝液做成50倍、500倍及5000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各2隻，每隻0.5mL，觀察4d。根據動物死亡情況，計算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力(MLD/mL或MLD/g)。例如：5倍、50倍及500倍稀釋致動物全部死亡，而注射5000倍稀釋液的動物全部存活，則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1000～10000MLD/mL。
定型試驗：
按毒力測定結果，用明膠磷酸鹽緩衝液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10～1000MLD/mL的範圍，分別與各單型肉毒抗診斷血清等量混勻，37℃作用30min，各注射小鼠2隻，每隻0.5mL，觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩衝液代替診斷血清，與稀釋毒素液等量混合作為對照。能保護動物免於發病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。
注：
1.未經胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結果，則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗。
2.為爭取時間盡快得出結果，毒素檢測的各項試驗也可同時進行。
3.根據具體條件和可能性，定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型。
4.進行確證及定型等中和試驗時，檢樣的稀釋應參照所用肉毒診斷血清的效價。
5.試驗動物的觀察可按陽性結果的出現隨時結束，以縮短觀察時間；唯有出現陰性結果時，應保留充分的觀察時間。
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