一、實驗目的和內容
目的：學習從土壤中分離微生物的方法，學習無菌操作技術。
內容：
l．用稀釋法分離細菌、放線菌和黴菌。
2．用平板劃線方法分離微生物。
3．學習斜麵接種及穿刺接種等無菌操作技術。
二、實驗材料和用具
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜麵菌種。
已滅菌的牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養基各1瓶，49.5mL無菌水(帶玻璃珠)1瓶，4.5mL無菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。
無菌培養皿12套，1mL無菌移液管10支，土壤樣品及天平、稱量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮。
三、操作步驟
(一)土壤稀釋分離
1．取土壤 取表層以下5—10cm處的土樣，放入無菌的袋中備用，或放在4℃冰箱中暫存。
2．製備稀釋液(要無菌操作)
(1)製備土壤懸液：稱土樣0.5g，迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底力最好)，振蕩5～10min，使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。
(2)稀釋：用無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL，放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液，如此重複，可依次製成10-3～10-8的稀釋液(圖3-1)。注意：操作時管尖不能接觸液麵，每一個稀釋度換用一支移液管，每次吸入土液後，要將移液管插入液麵，吹吸3次，每次吸上的液麵要高於前一次，以減少稀釋中的誤差。
3. 混菌法測定菌落數的方法
(1)細菌：取10-7、10-6兩管稀釋液各1mL，分別接人相應標號的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。然後取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養基，分別倒入以上培養皿中(裝量以鋪滿皿底高1.5～2mm為宜)，迅速輕輕搖動平皿，使菌液與培養基充分混勻，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細菌平板。倒平板時要注意無菌操作，見圖3-2。
圖3—2 倒平板的方法
（2）放線菌：取10-5、10-4兩管稀釋液，在每管中加入10%酚液5～6滴，搖勻，靜置片刻，然後分別從兩管中吸出1mL加入相應標號的平皿中，選用高氏1號培養基，用與細菌相同的方法倒入平皿中，便可製成放線菌平板。
（3）黴菌：取10-2、10-3兩管稀釋各1mL，分別接入相應標號的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。在融化的土豆蔗糖培養基中，每100mL加入滅菌的乳酸1mL，輕輕搖勻，然後用與細菌相同的方法倒入平皿中，便可製成黴菌的平板。
4．培養 將接種好的細菌、放線菌、黴菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，於28～30℃中恒溫培養，細菌培養1～2d，放線菌培養5～7d，黴菌培養3～5d。觀察生長的菌落，用於進一步純化分離或直接轉接斜麵。
（二）平板製作及劃線分離方法。
1．倒平板 按無菌操作要求，在火焰旁操作（圖3—2），做法如3（1）。
2．劃線分離 使用接種環，從待純化的菌落或待分離的斜麵菌種隻沾取少量菌樣，在相應培養基平板中劃線分離，劃線的方法多樣，目的是獲得單個菌落，主要方法參見圖3—3。
（三）斜麵接種和穿刺接種
1．斜麵接種
（1）取新鮮固體斜麵培養基，分別做好標記（寫上菌名、接種日期、接種人等），然後用無菌操作方法，把待接菌種接入以上新鮮培養基斜麵上。
（2）接種的方法是，用接種環沾取少量待接菌種，然後在新鮮斜麵上“之”字形劃線，方向是從下部開始，一直劃至上部（圖3—4A）。注意劃線要輕，不可把培養基劃破。
（3）接種後30℃ 恒溫培養，細菌培養48h，放線菌、黴菌培養至孢子成熟方可取出保存。
2．穿刺接種
（1）取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白腖柱狀培養基，做好標記（寫上菌名）、接種日期，接種人等）。
（2）接種的方法是，用接種針沾取少量待接菌種，然後從柱狀培養基的中心穿入其底部（但不要穿透），然後沿原刺入路線抽出接種針，注意接種針不要移動。
（3）接種後30℃恒溫培養， 24h後觀察，比較兩種菌的生長結果。
四、注意事項
1．一般土壤中，細菌最多，放線菌及黴菌次之，而酵母菌主要見於果園及菜園土壤中，故從土壤中分離細菌時，要取較高的稀釋度，否則菌落連成一片不能計數。
2．在土壤稀釋分離操作中，每稀釋10倍，最好更換一次移液管，使計數準確。
3．放線菌的培養時間較長，故製平板的培養基用量可適當增多。
五、實驗報告
1．記錄土壤稀釋分離結果，並計算出每克土壤中的細菌、放線菌和黴菌的數量。
計算方法：選擇長出菌落數30～300之間的培養皿進行計數，按以下公式：
總菌數/g=同一稀釋度幾次重複的菌落平均數×稀釋倍數
2．分別記錄平板劃線、斜麵接種的結果，並自我評價。
3．比較兩種細菌穿刺接種的結果，並進行分析。
七、問題和思考
1．在測定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什麽方法?
2．試設計實驗，從土壤中分離出酵母菌，並進行計數。
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