常用簡易保藏法
一、目的
了解常用簡易保藏法的原理，掌握其操作方法。
二、原理
常用簡易保藏法包括斜麵低溫保藏法、半固體穿刺保藏法、液體石蠟保藏法、甘油保藏法，沙上管保藏法等。由一這此保藏方法隻需要特殊設備，操作簡便易行，故為一般實驗空及生產單位所廣泛采用。
斜麵低溫保藏法和半固體穿刺保藏法是將在斜麵或半固體培養基上己生長好的培養物置於4~5℃冰箱屮保藏。這兩種方法都是利用低溫抑製微生物的生長繁殖，從而延長保藏時間。
液體石蠟保藏是在新鮮的斜麵培養物上，覆蓋一層經過滅菌的液體石蠟，再置於4~5℃冰箱中保藏。液體石蠟主要起隔絕空氣作用，故此法是利用缺氧低溫雙重抑製微生物生長，從而延長保藏時間。
甘油保藏法是在液體的新鮮培養物中加入適量的經過滅菌的甘油，然後再置於-20℃或-70℃冰箱中保藏。此法適用於甘油作為保護劑，甘油透入細胞後，能強烈降低細胞的脫水作用，同時在低溫條件下，可大大降低細胞代謝水平，達到延長保藏時間的目的。
沙土管保藏法是將待保藏菌種接種於斜麵培養基上，經培養後製成孢子懸液，將孢子懸液滴入已滅菌的沙土管中，孢子即吸附在沙子上，將沙土管置於真空幹燥器中，吸幹沙土管中水分，經密封後至於-4℃冰箱中保藏。此法利用幹燥、缺氧、缺乏營養、低溫等因素綜合抑製微生物生長繁殖，從而眼殘保藏時間。
三、材料
1.菌種 細菌、放線苗、酵母菌及黴菌。
2.培養基 肉膏蛋白腖斜麵及半固體深層培養基、豆芽汁葡萄糖斜麵培養基、高氏一號斜麵培養基、LB液體培養基。
3.其他 無菌液體石蠟、無菌甘油、帶螺口蓋和密封圈的無菌試管或1.5ml無菌Eppendorf管、100ml三角瓶。
四、方法與步驟
1.斜麵低溫保藏法（適用於細菌、放線菌、酵母菌及黴菌的保藏〕將菌種接種在適宜的培養基斜麵上，在適宜的溫度培養，使其充分生長。如果是能形成芽孢或孢子等休眠體的菌種，待形成芽孢成孢子等休眠體後再置於4~5℃冰箱中進行保藏。
不同種類的微生物有不同的保藏期，到期後需轉接至新的斜麵培養基上，經適當培養後，再行保藏。此法優點是操作簡便，不需要特殊設備；缺點是保藏時間短，菌種經反複轉接後，遺傳性狀已發生變異，生理活性減退。各類微生物的培養條件見表14-1。
2.半固體穿刺保藏法（適用於兼性厭氧細菌或酵母菌的保藏）用穿剌接種法將菌
種接入半固體深層培養基中央部分，注意不要穿透底部。在適宜的溫度培養，使其充分生長。培養好的菌種置於4-5℃冰箱保藏。一般保藏0.5a到1a後，需轉接到新的半固體深層培養基中，經培養後再行保藏。
3.液體石蠟保藏法〈適用於真菌和放線菌保藏）
（1）無菌液體石蠟製備 將液體石蠟罝1於100ml的三角瓶內，毎瓶裝10ml，塞上棉塞，外包牛皮紙、高壓蒸汽滅菌（0.1Mpa30min）。滅菌後將裝有液體石蠟的三角瓶置於105~110℃的烘箱內約1h，以除去液體石蠟中的水分。
(2)接種、培養及保藏 將菌種接種在適宜的斜麵培養基上，在適宜的溫度下培養，使其充分生長。用無菌吸管吸取無菌液體石蠟，注入到已生長好菌的斜麵上，液體石蠟的用量以高出斜麵頂端1cm左右為準，使菌種轉接至新的斜麵培養基上，培養後加入適量滅菌液體石蠟，再行保藏。
4.甘油保藏法（常用於細菌保藏）
（1）無菌甘油製備 將甘油置於100ml的三角瓶中，每瓶裝10ml，塞上棉塞，外包牛皮紙，高壓蒸汽滅菌（0.1Mpa20min）。
(2)接種、培養及保藏 挑取一環菌種接入LB液體培養基試管中，37℃振蕩培養至充分生長。用吸管吸取0.85ml培養液，置於一隻帶有螺口蓋和空氣密封圈的試管中或一支1.5ml的Eppendorf管中，再加入0.15ml無菌甘油，封口，振蕩混勻。然後將其置於乙醇-幹冰或液氮中速凍。最後將已冰凍的含有甘油的培養物置於-20~70℃保藏，保藏期為0.5~1a。
到期後，用接種環從凍結的表麵刮去培養物，接種至LB斜麵上，37℃培養48h。然後用接種環從斜麵上挑取一環長好的培養物，置入裝油2mlLB培養液的試管中，再加入2ml含30%無菌甘油的LB液體培養基，振蕩混勻。最後分裝於帶有螺口蓋和密封圈的無菌試管中或1.5的Eppendorf管中，按上述方法速凍保藏。
5.沙土管保藏法（適用於產孢子的芽孢杆菌、梭菌、放線菌和黴菌的保藏）
（1）無菌沙土管製備 取河沙若幹，用40目篩子過篩，出去大的顆粒。再用10%HCL溶液浸泡2-4h除去有機雜質，倒出鹽酸，用自來水從洗至中性，烘幹。另取非耕作層瘦黃土若幹，磨細，用100目篩子過篩。取1份製備的土加加4份沙混合均勻，裝入小試管中（如血清管大小）。裝量約1cm高即可，塞上棉塞，0.1Mpa滅菌1h，每天一次，連續3d。
（2）製備菌懸液 吸取3~5ml無菌水至一支已培養好的菌種斜麵中，用接種環輕輕攪動培養物，使呈菌懸液。
（3）加樣及幹燥 用無菌吸管吸取菌懸液，在毎支沙土管中滴加4~5滴菌懸液，塞上棉塞，振蕩搖勻。將已滴加菌懸液的沙土管置於預先放有五氧化二磷或無水氯化鈣的幹燥器內。當五氧化二磷或無水氯化鈣因吸水變成糊狀時，則應進行更換。如此數次，沙土管即可幹燥。也可用真空泵連續抽氣約3h，即可達到幹燥效果。
（4）抽樣檢查 從柚幹的沙土管中，每10支抽取1支進行檢査。用接種環取少許沙土，接種到適合於所保藏菌種生長的斜麵上，進行培養，觀察所保藏菌種的生長及有無雜菌生長情況。
（5）保藏 檢查合格後，可采用以下方法進行保藏：①沙土管繼續放入幹燥器中，置於室溫或冰箱中。②將沙土管帶塞一端浸人熔化的石蠟中，密封管口。③在煤氣燈上，將沙土管的棉塞下端的玻璃燒熔.封住管口，再置4℃冰箱中保藏。此法可保截菌種1年到數年。
表14-1各種微生物斜麵培養條件及保藏期
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菌類 |
培養基名稱 |
培養溫度（℃） |
培養時間（d） |
保藏溫度（℃） |
保藏時間（min） |
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細菌 |
肉膏蛋白腖斜麵 |
30~37 |
1-2 |
4-5 |
1-3 |
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放線菌 |
馬鈴薯葡萄糖或 高氏合成一號斜麵 |
25~30 |
5-7 |
4-5 |
3-6 |
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酵母菌 |
豆芽汁葡萄糖或 麥芽汁斜麵 |
25~30 |
2-3 |
4-5 |
2-4 |
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霍菌 |
豆芽汁葡萄糖或 麥芽汁斜麵 |
25~30 |
3-5 |
4-5 |
3-6 |
