目的：初步掌握細菌塗片方法及革蘭氏染色法步驟。
內容：1．製作細菌染色裝片。
2．進行革蘭氏染色法操作。
二、實驗材料和用具
蘇雲金杆菌或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸杆菌(E.coli)菌液，待測菌菌液1～2種。
革蘭氏染色液(結晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸複紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。
三、操作步驟
(一)製片
1．塗菌 用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環，用接種環在潔淨無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。塗菌後將接種環火焰滅菌。
2．幹燥 於空氣中自然幹燥。亦可把玻片置於火焰上部略加溫加速幹燥(溫度不宜過高)。
3．固定 目的是殺死細菌並使細菌粘附在玻片上，便於染料著色，常用加熱法，即將細菌塗片膜向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此製片可用於染色。
(二)染色
l．初染 於製片上滴加結晶紫染液，染lmin後，用水洗去剩餘染料。
2．媒染 滴加盧戈氏碘液，lmin後水洗。
3．脫色 滴加95%乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止 (根據塗片之厚薄需時30s至lmin)，水洗。
4．複染 滴加石炭酸複紅液複染lmin，水洗。
5．濾紙吸幹，油鏡鏡檢。
(三)結果
革蘭氏陽性菌染成藍紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。
(四)檢測未知菌
用以上方法對未知菌進行革蘭氏染色，並繪圖、記錄染色結果。
四、注意事項
1. 塗片務求均勻，切忌過厚。
2．在染色過程中，不可使染液幹涸。
3．脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會使陰性菌被染成陽性菌。
4．老齡菌因體內核酸減少，會便陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。
五、實驗報吉
(一)繪圖
1．大腸杆菌革蘭氏染色視野圖。
2．金黃色葡萄球菌或蘇雲金杆菌革蘭氏染色視野圖。
(二)記錄革蘭氏染色法法步驟，並進行結果分析。
(三)未知菌的檢測結果。
六、問題和思考
1．塗片後為什麽要進行固定?固定時應注意什麽?
2．什麽是革蘭氏染色法?染色過程應注意什麽?
3．試分析革蘭氏染色法在細菌分類中的意義。
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