標本塗片、革蘭染色、鏡檢，觀察細菌的形態和染色性，並估計標本中大致的含菌量，可用“少量”， “+ ”、“ ++ ”、“ +++”、“++++ ”表示。鏡檢不僅能反映各種厭氧菌的特殊形態，同時也能為鑒定厭氧菌提供參考和依據。如脆弱擬杆菌菌體細長，兩端尖;韋榮球菌是極小的革蘭陰性球菌。厭氧菌芽胞的位置、形態、大小對鑒定很有意義，必要時作芽胞形成試驗。
二、標本接種
一般標本接種3 個血瓊脂平板，分別放置於有氧、無氧和含5 %~ lO % CO2 的環境中培養。如果隻要求檢出厭氧菌，隻需接種l 個厭氧血瓊脂平板，也可增加1 個相應的選擇厭氧血瓊脂平板。為便於在混合培養中及早發現厭氧菌，一般將標本分3 段劃線接種，在第1 和第2 段交界處貼1 張甲硝嘩(5 mg/片)紙片，若出現隱約抑菌圈，則提示有厭氧菌生長。
不同厭氧菌的生長速度和菌落形態各異，色素也有不同，熒光產生與否也有助於鑒定，根據上述特征，可初步推測厭氧菌的種類。
1.革蘭陰性杆菌
(1)在BBE 瓊脂平板上有灰黑色、直徑 >lmm 的菌落，菌落周圍有黑色的暈，可初步鑒定為脆弱擬杆菌。
(2) 在卡那萬古溶血瓊脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德燈照射有磚紅色熒光者，為產黑素普雷沃菌。
(3)菌落沉入瓊脂內，使培養基表麵留有小坑者，可能是解脲擬杆菌和纖細擬杆菌。
(4)菌落表麵有小斑點，或如麵包屑，結合塗片所見，可初步鑒定為具核梭杆菌。
2. 革蘭陰性球茵菌體很小，排列成雙、短鏈或小堆，菌落小，不透明，可能是小韋榮球菌。
3. 革蘭陽性球菌排列成長短不等的鏈，可能是消化鏈球菌。
4. 蘋蘭陽性無芽月色杆菌
(1)菌落呈臼齒形、粗糙，結核腋樣分泌物中有硫黃樣顆粒，可能是放線菌。
(2)菌體呈X 、Y 、V 排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。
5. 蘋蘭陽性芽胞杆菌隻要見有芽胞，即可鑒定為梭菌屬。菌落有雙環溶血，卵黃平皿上卵磷脂酶試驗和Nagler 試驗陽性，塗片染色為革蘭陽性短粗杆菌，有芽胞，有英膜，可鑒定為產氣莢膜梭菌。
三、耐氧試驗
當厭氧平板上有細菌生長時，為了確定是否為厭氧菌，必須做耐氧試驗。從每個瓊脂平板上挑取4~5 個性狀不同的菌落，每個菌落分別轉種於2 塊需氧血瓊脂平板和1 塊厭氧血瓊脂平板(每個瓊脂平板可劃4~6 區，每區種一個可疑菌落) ，然後將平板分別放置在需氧、二氧化碳和厭氧環境中培養。
凡在厭氧環境生長，而在需氧和二氧化碳環境中不生長的細菌為專性厭氧菌(圖3 - 48 中A 區) ;在需氧和厭氧環境中均能生長者為兼性厭氧菌(圖3 - 48 中B 區) ;在需氧和二氧化碳環境中生長，而在厭氧環境中不生長者為專性需氧菌(圖3 - 48 中C 區) ;在需氧、厭氧環境中均不生長或生長不佳，而在二氧化碳環境中生長良好的細菌為需二氧化碳菌(圖3 - 48 中D 區) 。 
四、鑒定試驗
可依據厭氧菌的菌體染色形態、菌落特性以及對某些抗生素的敏感性作出初步鑒定。最後鑒定則要進行生化反應及終末代謝產物等檢查。
生化試驗主要包括多種糖類發酵試驗、嗬|喋試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、卵磷脂酶試驗、脂酶試驗、明膠液化試驗及膽汁肉湯生長試驗和硫化氫試驗等。目前用於厭氧菌快速鑒定有胞外酶試驗， 4 h 即可觀察結果;自動微生物鑒定係統，如VITEK-ANI 、MicroScan- ANI 等也可鑒定厭氧細菌。
在進行厭氧菌分離鑒定的過程中，需注意下列事項: ①厭氧菌標本在采集和運輸的過程中必須與空氣隔絕(厭氧菌暴露於空氣中時間太長可死亡) ，務必在30 min 內完成，同時應避免正常菌群的汙染。②培養基要新鮮配製，若儲存太久，有氧氣溶解在表麵或有過氧化物在培養基中，不利於厭氧菌生長。③ 若菌落太小，需用放大鏡觀察菌落。④作耐氧試驗，要求從每個瓊脂平板上挑取4 ~ 5 個性狀不同的菌落，分別接種需氧和厭氧血瓊脂平板，置於需氧、二氧化碳和厭氧環境中培養。⑤ 如作胞外酶鑒定， 一定要有足夠的菌液濃度。
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