一、實驗目的和內容
目的：了解自然存在的酵母菌及其形態結構。了解酵母菌產生子囊孢子的條件及其形態。
內容：
1．觀察酵母菌個體形態。
2．觀察酵母菌的假菌絲和繁殖過程。
3．觀察自然狀態的酵母菌。
二、實驗材料和用具
釀酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)斜麵菌種。
PDA培養基、麥氏(McCLary)培養基(醋酸鈉培養基)、0.05%美藍染色液(以pH6.0的0.02mol/L磷酸緩衝液配製)、碘液、0.04%的中性紅染色液%孔雀綠，0.5%沙黃液、95%乙醇；
顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環、V形玻璃棒、放置一個三角形玻璃棒支架的培養皿。
三、操作步驟
(一)酵母菌形態觀察
1．酵母菌的話體染色觀察及死亡率的測定
(1)以無菌水洗下PDA斜麵培養的釀酒酵母菌苔，製成菌懸液。
(2)取0.05%美藍染色液1滴，置載玻片中央，並用接種環取酵母菌懸液與染色液混勻，染色2～3min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母菌個體形態，區分其母細胞與芽體，區分死細胞(藍色)與活細胞(不著色)。
(3)在一個視野裏計數死細胞和活細胞，共計數5～6個視野。
酵母菌死亡率一般用百分數來表示，以下式來計算：
死亡率=死細胞總數÷死活細胞總數×100%
2．酵母菌液泡係的話體觀察 於潔淨載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀察。細胞無色，液泡呈紅色。
3．酵母菌細胞中肝糖粒的觀察 將1滴碘液置於載玻片中央，接人上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察，細胞內的貯藏物質肝糖顆粒呈深紅色。
4．酵母菌子囊孢子的觀察
(1)活化釀酒酵母：將釀酒酵母接種至新鮮的麥芽汁培養基上，置28C培養2～3d，然後再移植2～3次。
(2)轉接產孢培養基：將活化的釀酒酵母轉接至醋酸鈉培養基上，置30℃恒溫培養14d。
(3)觀察：挑取少許產孢菌苔於載玻片的水滴上，經塗片、熱固定後，加數滴孔雀綠，lmin後水洗，加95%乙醇30S，水洗，最後用0.5%沙黃液複染30S，水洗去染色液，最後用吸水紙吸幹。製片幹燥後，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。注意觀察子囊孢子的數目、形狀和子囊的形成率。
(4)計算子囊形成的百分率：計數時隨機取3個視野，分別計數產子囊孢子的子囊數和不產孢子的細胞，然後按下列公式計算：
子囊形成率（%）=3個視野中形成子囊的總數
÷3個視野中（形成子囊的總數+不產孢子細胞總數）×100%
5．酵母菌假菌絲的觀察 取一無菌載玻片浸於溶化的PDA培養基中，取出放在溫室培養的支架上，待培養基凝固後，進行酵母菌劃線接種，然後將無菌蓋玻片蓋在接菌線上(圖12—1)，28℃培養2～3d後，取出載玻片，擦去載玻片下麵的培養基，在顯微鏡下直接觀察。可見到芽殖酵母形成的藕節狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節狀假菌絲(圖12—2)。
6．自然狀態下的酵母菌觀察 取一滴美藍染色液於載玻片中央，春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜，冬季取醃酸菜湯上的白膜，將其置於載玻片染色液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下仔細觀察酵母菌形態，出芽生殖，假菌絲等。
四、注意事項
1．用於活化酵母菌的麥芽汁培養基要新鮮、表麵濕潤。
2．在產孢培養基上加大移種量，可提高子囊形成率。
3．通過微加熱增加酵母的死亡率，易於觀察死亡細胞。
五、實驗報告
(一)繪圖
1．數個酵母菌細胞，示觀察到的結構。
2．數個子囊及子囊孢子形態圖。
(二)記錄並計數酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始記錄及計算結果)。
六、問題和思考
1．酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與黴菌的真菌絲有何區別?
2．如何區別營養細胞和釋放出的子囊孢子?
3．試設計一個從子囊中分離子囊孢子的試驗方案。
注：
酵母菌的簡易培養 配2%葡萄糖水(或自糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液麵高度2～2cm )，加HCl調至pH3～5放入幾塊葡萄皮（或其他糖分較高的果皮），置5～28℃溫箱中培養2～3d，聞到酒香味後，即可取培養液鏡檢
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