所有微生物都受到其生存環境中pH的影響。通常,選擇性物質的存在會縮小它們生長的pH範圍。有時，培養基的酸度或堿度也能作為一種生長選擇因子。而對於生化測試培養基，微生物在基質中顯示活性的的範圍比生長所需的pH範圍窄。因此，將培養基的pH調至預期的範圍內是很重要的。當實驗室根據培養基成分自己配製培養基時，必須檢測並調整pH。必須指出的是，即使是生產廠商提供的現成的合成脫水培養基(尤其是對一些庫存的脫水培養基)，在製成實驗用培養基後也需要對其最終pH進行測定。
測定培養基pH的最準確的方法是使用pH計，使用前必須用已知pH的（通常pH為4-7)標準緩衝溶液進行校準。將pH計的電極用蒸餾水衝洗後浸入到燒杯的培養基中，就可以從pH計的刻度讀出培養基的pH。每個生產廠商對每種不同pH計都提供有詳細的操作說明。
配製培養基時，使用帶機械攪拌的pH計可以很容易地調整pH。
培養基位在能夠不停攪拌的容器(如大燒杯）中配製，最好使用磁力攪拌器，磁力攪拌器帶有聚乙烯或聚四氟乙烯包裝的磁棒。含瓊脂的培養基需在融化後調整其pH，用可加熱的磁力攪拌器很容易辦到。調節pH時用已知pH的標準緩衝液溶液先對pH計進行校準。然後將複合電極和電阻溫度計(如果有)置於培養基，從燒杯遠離電極的一端緩慢加人適量的鹽酸和氫氧化鈉，保到培養基達到並保持所需的pH。
pH計的溫度補償應考慮到溫度對電極係統的影響：在一些稀釋液和培養基中，pH隨溫度的變化而有相當大的變化。對於液體培養基和稀釋液而言，通常既可以在25℃下,也可以在其使用時的溫度下調整和測定。
瓊脂培養基必須在溶解後進行pH的調整，溶解的溫度在45℃以上。因此，固體培養基應在其使用溫度確定pH。這時應使用平頭的複合電極，同時用手動校準pH計的溫度補償。在製備培養基時,若測定出培養基在熔化狀態和凝固狀態的pH有所不同時，說明在調整pH產生誤差。
同樣，製備的培養基在加熱滅菌處理(如高壓滅菌〉時，也可能會產生pH的變化。對於脫水培養基，生產廠商己考慮到這一點，通常不謠要再調整其pH。但應認真核對待用培養基的pH。如果脫水的瓊脂培養基在再次溶解或製備的過程中必須調整pH，那麽最好在滅菌操作步驟之後用過濾滅菌的鹽酸和氫氧化鈉溶液進行調整，以避免造成因再次滅菌而形成的培養基的過度加熱。當用不同的原枓或藥品製備培養基時，必須在高壓滅菌後檢測培養基的pH。此外，如果發現培養基的在每次高壓滅菌後都發生相同變
化，可在配製培養基時對pH進行適當調整。但仍需測定培養基滅菌後的最終pH。
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