一 顯微鏡直接計數法
（一）目的要求
1．明確血細胞計數板計數的原理。
2．掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。
（二） 基本原理
顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置於一種特別的具有確定麵積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，於顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用於酵母、細菌、黴菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。後兩種計菌器由於蓋上蓋玻片後，總容積為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離隻有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察塗片麵積與視野麵積之比的估算法，此法一般用於牛乳的細菌學檢查。顯微鏡直接計數法的優點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結合活菌染色微室培養（短時間）以及加細胞分裂抑製劑等方法來達到隻計數活菌體的目的。本實驗以血球計數板為例進行顯微鏡直接計數。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。
用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。該計數板是一塊特製的載玻片，其上由四條槽構成三個平台；中間較寬的平台又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平台上各列有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數室。血細胞計數板構造如圖l5-1。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規格的計數板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的麵積為lmm2，蓋上蓋玻片後，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。
計數時，通常數五個中方格的總菌數，然後求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數，然後再換算成lml菌液中的總菌數。
設五個中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，如果是25個中方格的計數板，則
1mL菌液中的總菌數=A/5×25×104×B=50000A•B（個）
同理，如果是16個中方格的計數板，
1mL菌液中的總菌數=A/5×16×104×B=32000A•B（個）
（三）器材
1．菌種 釀酒酵母
2．儀器或其他用具 血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。
（四）操作步驟
l．菌懸液製備
以無菌生理鹽水將釀酒酵母製成濃度適當的菌懸液。
2．鏡檢計數室
在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有汙物，則需清洗，吹幹後才能進行計數。
3．加樣品
將清潔幹燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。
取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生。
4．顯微鏡計數
加樣後靜止5min，然後將血細胞計數板置於顯微鏡載物台上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然後換成高倍鏡進行計數。
調節顯微鏡光線的強弱適當，對於用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數室方格線，或隻見豎線或隻見橫線。
在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度後再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5~10個菌體為宜。每個計數室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數。位於格線上的菌體一般隻數上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算樣品的含菌量。
5．清洗血細胞計數板
使用完畢後，將血細胞計數板在水龍頭用水衝洗幹淨，切勿用硬物洗刷，洗完後自行晾幹或用吹風機吹幹。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉澱物。若不幹淨，則必須重複洗滌至幹淨為止。
（五）實驗報告
l．結果
將結果記錄於下表中。A表示五個中方格中的總菌數；B表示菌液稀釋倍數。
各中格中菌數 A B 二室平均值 菌數/ml
1 2 3 4 5
第一室
第二室
2．思考題
(1)根據你的體會，說明用血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方麵?應如何盡量減少誤差．力求準確?
(2)某單位要求知道一種幹酵母粉中的活菌存活率，請設計1～2種可行的檢測方法。
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