（一）目的要求
學習平板菌落計數的基本原理和方法。
（二）、基本原理
平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋之後，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。但是，由於待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數的結果，現在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對菌落數來表示樣品的活菌含量。
平板菌落計數法雖然操作較繁，結果需要培養一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由於該計數方法的最大優點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用於生物製品檢驗(如活菌製劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數或汙染程度的檢測。
（三）器材
1．菌種 大腸杆菌菌懸液。
2．培養基 牛肉膏蛋白腖培養基。
3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養箱等。
（四）操作步驟
l．編號
取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2．稀釋
用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸杆菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多餘的菌液放回原菌液中。
將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10 1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液麵，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。……其餘依次類推，整個過程如圖15-3所示。
放菌液時吸管尖不要碰到液麵，即每一支吸管隻能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。
3，取樣
用三支1mL無菌吸管分別吸取10-4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2mL。
不要用lmL吸管每次隻靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個重複平板間的操作誤差。
4．倒平板．
盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化後冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白腖培養基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養基與菌液混合均勻，而又不使培養基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。
由於細菌易吸附到玻璃器皿表麵，所以菌液加入到培養皿後，應盡快倒入融化並於已冷卻至45℃左右的培養基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數。
待培養基凝固後，將平板倒置於37℃恒溫培養箱中培養。
5．計數
培養48h後，取出培養平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，並按下列公式進行計算，
每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重複的平均菌落數×稀釋倍數×5
一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重複對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重複對照平板不能少於三個，這樣便於數據統計，減少誤差。由10-4、10-5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數也不應相差太大。
平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養後所出現的平均菌落數在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。
平板菌落計數法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用塗布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是後者先將牛肉膏蛋白腖培養基融化後倒平板，待凝固後編號，並於37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作台上適當吹幹，然後用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種於不同稀釋度編號的平板上，並盡快用無菌玻璃塗棒將菌液在平板上塗布均勻，平放於實驗台上20～30min，使菌液滲入培養基表層內，然後倒置37℃的恒溫箱中培養24～48h。
塗布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少菌液不易塗布開，過多則在塗布完後或在培養時菌液仍會在平板表麵流動，不易形成單菌落。
五、實驗報告
1．結果
2．將培養後菌落計數結果填入下表
2．思考題
(1)為什麽融化後的培養基要冷卻至45℃左右才能倒平板?
(2)要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵?為什麽?
(3)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優缺點及應用。
(4)當你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認為問題出在哪裏?
(5)用倒平板法和塗布法計數，其平板上長出的菌落有何不同?為什麽要培養較長時間(48h)後觀察結果?
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