一、目的要求
1．了解光電比濁計數法的原理。
2．學習、掌握光電比濁計數法的操作方法。
二、基本原理
當光線通過微生物菌懸液時，由於菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的範圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一係列已知菌數的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數標準曲線。然後，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數。製作標準曲線時，菌體計數可采用血細胞計數板計數，平板菌落計數或細胞幹重測定等方法。本實驗采用血細胞計數板計數。
光電比濁計數法的優點是簡便、迅速，可以連續測定，適合於自動控製。但是，由於光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態、培養液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對於不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數應采用相同的菌株和培養條件製作標準曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經過最大吸收波長以及穩定性試驗來確定。另外，對於顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他幹擾物質的懸液不適合用此法進行測定。
（三）器材
1．菌種 釀酒酵母培養液
2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。
（四）操作步驟
1．標準曲線製作
（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。
（2）調整菌液濃度 用血細胞計數板計數培養24小時的釀酒酵母菌懸液，並用無菌生理鹽水分別稀釋調整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。
（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻後於560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，並將OD值填入下表
每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻後再倒入比色皿中測定
(4)以光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數為橫坐標，繪製標準曲線。
2．樣品測定
將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻後，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。
各種操作條件必須與製作標準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數就不準確。
3．根據所測得的光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數。
（五）實驗報告
l．結果
每毫升樣品原液菌數=從標準曲線查得每毫升的菌數×稀釋倍數
2．思考題
(1)光電比濁計數的原理是什麽?這種計數法有何優缺點?
(2)光電比濁計數在生產實踐中有何應用價值?
(3)本實驗為什麽采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實驗中需要測定大腸杆菌生長的OD值，你將如何選擇波長?
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