一、實驗目的和內容
目的：學習培養厭氧微生物的方法，了解厭氧微生物生長的特性。
內容：1、深層穿刺法，厭氧培養丙酮丁醇梭菌。
2、真空幹燥器厭氧培養丙酮丁醇梭菌及產氣莢膜梭菌。
3、針筒厭氧法培養丙酮丁醇梭菌及產氣莢膜梭菌。
4、厭氧罐培養法示範。
5、厭氧袋法培養丙酮丁醇梭菌。
二、實驗材料和用具
丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)。
RCM培養基（即強化梭菌培養基）、TYA培養基、玉米醪培養基、中性紅培養基、明膠麥芽汁培養基。CaCO3，焦性沒食子酸(即鄰苯三酚)、Na2CO3，10%NaOH溶液，0.5%美藍水溶液，6%葡萄糖水溶液，鈀粒(A型)，NaBH4，KBH4，NaHCO3，檸檬酸。
帶塞或塑料帽玻璃管(直徑18~20mm，長180~200mm)，1mL血漿瓶，250mL血漿瓶，2OmL和50mL針簡，250mL三角瓶，試管，厭氧罐，厭氧袋(不透氣的無毒複合透明薄膜塑料袋，14cm×32cm)，培養皿，真空泵，帶活塞幹燥器，氮氣鋼瓶。
三、操作步驟
(一)真空幹燥器厭氧培養法
此法不適用於培養需要CO2的微生物。該法是在幹燥器內使焦性沒食子酸與氫氧化鈉溶液發生反應而吸氧，形成無氧的小環境而使厭氧菌生長。
1．培養基準備與接種 將3支裝有玉米醪培養基或RCM培養基的大試管放在水浴中煮沸l0min，以趕出其中溶解的氧氣，迅速冷卻後(切勿搖動)將其中2支試管分別接種丙酮丁醇梭菌和產氣莢膜梭菌。
2．幹燥器準備與抽氣 在帶活塞的幹燥器內底部，預先放入焦性沒食子酸粉末20g和斜放盛有200mL10% NaOH溶液的燒杯。將接種有厭氧菌的培養管放入幹燥器內。在幹燥器口上塗抹凡士林，密封後接通真空泵，抽氣3~5min，關閉活塞。輕輕搖動幹燥器，促使燒杯中的NaOH溶液倒入焦性沒食子酸中，兩種物質混合發生吸氧反應，使幹燥器中形成無氧小環境(圖18-lA)
3．觀察結果 將幹燥器置於37℃恒溫箱中培養約7d，取出培養管，分別製片觀察菌體特征。
(二)深層穿刺厭氧培養法
此法操作簡單，適用於一般厭氧微生物的活化和分離培養，但不能用於擴大培養。
1．接種培養 將玻璃管一頭塞上橡膠塞，裝入培養基(RCM或TYA培養基)的高度為管長的2/3，套上塑料帽或橡皮塞，滅菌並凝固後，將丙酮丁醇梭菌用接種針穿刺接種(圖18—lB)，置37℃恒溫箱中培養6～7d。
2．觀察結果 觀察菌落形態特征並製片於顯微鏡下觀察菌體的細胞形態，並記錄結果。
(三)針筒厭氧培養法
此法適於活化厭氧菌和小體積的擴大培養。
1．培養基準備 將滅菌的裝有RCM或TYA培養基的血漿瓶放在沸水浴中加熱10min，在瓶口膠塞上插上2枚醫用針頭排氣，以趕出殘留在培養基內的氧氣。隨後將血漿瓶從沸水浴中取出，再用氮氣鋼瓶中的高純氮氣(99.99%)通過膠塞上的一枚針頭引人血漿瓶中，使血漿瓶內充滿氮氣，瓶內培養基在冷卻過程中保持無氧狀態。
2．針筒裝灌培養基 將滅菌的針筒接上針頭經膠塞刺人血漿瓶中，先利用瓶內氮氣的壓力將針筒的推杆慢慢推開，待吸入一定體積的氮氣後取下針筒，排盡針筒內的氣體。按此重複操作3次，以排盡針筒內的殘留空氣而維持無氧狀態。使血漿瓶口朝下傾斜，利用瓶內壓力將培養液緩慢注入針筒內，然後取下針筒，用經滅菌的帶孔橡皮塞迅速把針筒頭部塞住(圖18-2)。
3．接種培養采用無菌操作以菌種液針筒將菌穿刺接入培養液針筒中(圖18-3)，置37℃恒溫培養，用於菌種活化可培養16~18h，用於測定菌體生長可培養6~7d。
4．觀察結果取菌製片觀察。
(四)厭氧罐培養法
此法利用透明的聚碳酸酯硬質塑料製成的一種小型罐狀密封容器，采用抽氣換氣法充入氫氣，利用鈀作催化劑與罐內氧氣發生作用達到除氧的目的，同時充入10%(V/V)的CO2以促進某些革蘭氏陰性厭氧菌的生長(圖18-4)。
其實驗操作過程如下：
1．製備厭氧度指示劑 取3mL0.5%美藍水溶液用蒸餾水稀釋至100mL；6mL0.1mol/LNaOH溶液用蒸餾水稀釋至l00mL；6g葡萄糖加蒸餾水至l00mL。將上述3種溶液等體積混合，並用針筒注入安瓿管內lmL，沸水浴加熱至無色，立即封口即成。取一根直徑1cm、長8cm的無毒透明塑料軟管，將裝有美藍指示劑的安瓿管置於軟管中，製成美藍厭氧度指示管。
2．培養基準備與接種 將製成無菌無氧的RCM或TYA培養基平板，在無菌操作下迅速劃線接種丙酮丁醇梭菌或產氣莢膜梭菌，並立即將平皿倒置放入已準備好的厭氧罐中，同時放入一支美藍厭氧指示劑管。隨後及時旋緊罐蓋，達到完全密封。
3．抽氣換氣 將真空泵接通厭氧罐抽氣接口(圖18-4)，抽真空至表指針0.09~0.093MPa(680~700mmHg柱)時，關閉抽氣口活塞，用止血鉗夾住抽氣橡皮管。打開氮氣鋼瓶氣閥向厭氧罐內充入氮氣，當真空表指針返回到零位終止充氮。再接上述步驟抽氣和充入氮氣，如此重複2~3次，使罐中氧的含量達最低度。最後充入的氮氣使真空表指針達0.02MPa(l60mmHg)時停止充氮氣。再開啟CO2鋼瓶閥門，向罐內充入CO2直至真空表指針達到0.011MPa(80mmHg)時停止。為除盡罐內殘留的氧，以氫氣袋(用醫用“氧氣袋”灌滿氫氣)氣管連接向厭氧罐內充入氫氣直至真空表指針回到零位為止。充氣完畢，封閉厭氧罐。
4．恒溫培養 將厭氧罐置於37℃恒溫箱中培養6~7d，注意罐中厭氧指示劑的顏色變化。
5．觀察結果和鏡檢 從罐內取出平皿，觀察菌落特征。並挑取菌落作塗片，用結晶紫染液染色，鏡檢，比較不同菌的菌體細胞形態特征，並作記錄。
(五)厭氧袋培養法
厭氧袋除氧是利用氫硼化鈉與水反應產生氫，在催化劑鈀的作用下，氫與袋中氧結合生成水達到除氧目的，除氧效果可從袋中厭氧度指示劑觀察。同時，利用檸檬酸與碳酸氫鈉的作用產生CO2，以有利於需要CO2的厭氧菌的生長。
其反應過程為：
1．厭氧袋 選用無毒複合透明薄膜塑料，采用塑膜封口機或電熱法燙製成20×40cm塑料袋。
2．產氣管 取一根無毒塑料軟管(直徑2.0cm，長20cm)，管壁製成小孔，一端封實。天平稱取0.4g NaBH4和0.4g NaHCO3，用擦鏡紙包成小包，塞入軟管底部，其上基入3層擦鏡紙，將裝有5%檸檬酸溶液3mL的安瓿管塞入塑料管中，管口塞上有缺口的泡沫塑料小塞，即製成產氣管。
3．厭氧度指示管 取一根無毒透明塑料軟管(直徑2cm，長10cm)。量取0.5%美藍水溶液3mL，用蒸餾水稀釋至100mL；取0.lmol/LNaOH溶液6mL，用蒸餾水稀釋至100mL；稱取6g葡萄糖加蒸餾水稀釋成100mL。將上述3種溶液等量混合後取2mL裝入安瓿管，經沸水浴加熱至無色後立即封口，即為厭氧度指示管。
4．催化劑和吸濕劑 催化劑鈀粒(A型)10~20粒加熱活化，隨後裝入帶孔的小塑料硬管內，製成鈀粒催化管。取變色矽膠少許，用濾紙包好塞入帶孔塑料管內，為吸濕劑管。
5．培養基準備和接種 將滅菌的中性紅培養基和CaCO3明膠培養基分別在沸水浴中煮沸10min，以趕出其中溶解的氧，冷卻至50C左右倒平板，冷凝後接種丙酮丁醇梭菌。隨後立即將平皿放入厭氧袋中，每袋可倒置平放3個平皿。
6．封袋除氧和培養 將產氣管、厭氧度指示管、鈀粒催化劑管和吸濕劑管分別放入袋中平皿兩邊，盡量趕出袋中空氣，用寬透明膠帶將袋口封住，用一根lcm寬、與袋口寬等長的有機玻璃條或小木條將袋口卷折2~3層，用夾子夾緊，嚴防漏氣(圖18-5)。使袋口傾斜向上，隨後隔袋折斷產氣管中的安瓿管頸，使試劑反應產生H2和CO2，H2在鈀粒催化下與袋內O2化合生成水。經5~l0min左右，鈀粒催化管處升溫發熱，生成少量水蒸汽。在折斷產氣管半小時後，隔袋折斷厭氧度指示管中的安瓶管頸，觀察指示劑不變藍，表明袋內己形成厭氧環境。此時將厭氧袋轉入37℃恒溫箱中培養6~7d。
7．觀察結果和鏡檢 從袋中取出平皿觀察菌落特征。丙酮丁醇梭菌在中性紅平板上顯示黃色菌落，挑取典型單菌落塗片染色後進行鏡檢，觀察菌體細胞形態特征，並作記錄。
四、注意事項
1．培養需要CO2的厭氧菌時，須在厭氧小環境中供應CO2。
2．氫氣是危險易爆氣體，使用氫氣鋼瓶充氫時，應嚴格按操作規程進行，切勿大意，嚴防事故。
3．選用幹燥器、針筒、厭氧罐或厭氧袋時，應事先仔細檢查其密封性能，以防漏氣。
4．已製備滅菌的培養基在接種前應在沸水浴中煮沸10min，以消除溶解在培養基中的氧氣。
5．針筒培養液刃天青指示劑出現紅色，表明有殘留氧氣。厭氧袋和厭氧罐中美藍厭氣度指示劑變成藍色，表明除氧不夠。
6．產氣莢膜梭菌為條件致病菌，防止進入口中和沾上傷口。
五、演示
1．顯示深層穿刺厭氧培養的厭氧菌菌落特征及生長情況。
2．選用真空幹燥器、針筒、厭氧罐或厭氧袋厭氧培養法，演示該方法的操作過程，特別是厭氧罐的抽氣換氣和厭氧袋的封袋除氧操作過程。
六、實驗報告
1．實驗中選用厭氧培養法的培養結果：
2．試比較以上厭氧培養方法的優缺點，並分析其成功的關鍵。
七、問題和思考
1．請設計一個試驗方案，如何從土壤中分離、純化和培養出厭氧菌。
2．試舉例說明研究厭氧菌的實際意義。
上一篇：微生物與氧關係的檢測
下一篇：免疫血清的製備
