一、實驗目的和內容
目的：學習和掌握免疫血清的製備方法，為凝集反應和沉澱反應準備凝集素和沉澱素。
內容：1、抗大腸杆菌血清(凝集素)的製備。
2、牛血清白蛋白抗血清(沉澱素)的製備。
二、實驗材料和用具
體重2~3kg的健康雄家兔、大腸杆菌(E. coli)斜麵菌種；
牛血清白蛋白(蛋白含量1.5mg/mL)、牛肉膏蛋白腖斜麵培養基、0.3%甲醛液(用0.85%生理鹽水配製)、75%酒精棉球、碘酒棉球、消毒幹棉球；
細菌比濁標準管、無菌吸管、無菌注射器(5mL、20mL)、注射針頭(5號，B19)、無菌試管、裝有玻璃珠的無菌血清瓶、解剖用具(解剖台、兔頭夾、止血鉗、解剖刀、眼科剪刀、鑷子、動脈夾等)、雙麵刀片、絲線、玻璃管、膠管、離心機及無菌離心管、普通冰箱、超淨工作台、水浴箱。
三、操作步驟
(一)凝集素的製備
1．凝集原(顆粒性抗原)的製備
(1)取37C恒溫培養24h的牛肉膏蛋白腖大腸杆菌斜麵。
(2)每支斜麵菌種中加入5mL0.3%甲醛液，小心地把菌苔洗下製成菌液。
(3)用無菌清潔吸管，吸取以上菌液，注入裝有玻璃珠的無菌血清瓶內，振蕩10~25min，分散菌塊製成菌懸液。
(4)將含菌懸液的血清瓶置於60℃的水浴箱中水浴1h，並不時搖動，把菌殺死。
(5)將菌懸液重新接種至牛肉膏蛋白腖斜麵培養基中，37℃培養24～48h，如有菌生長，則要在60℃水溫中再處理。若無菌生長則進行比濁測定其含菌量。
(6)凝集素的製備
(1)免疫方法：選擇2～3kg健康雄免，從耳緣靜脈采血2mL，分離出血清。該血清與準備免疫用的抗原進行凝集反應，以檢查有無天然凝集素。如沒有或隻有極微量時，該動物便可用來免疫。
最常用的免疫途徑是耳緣靜脈注射。將家兔放在家兔固定箱內，一手輕輕拿起耳朵，用碘酒棉花球在耳外側邊緣靜脈處消毒，然後用酒精棉球塗擦，並用手指輕輕彈幾下靜脈血管，使其擴張。消毒細菌懸液瓶塞後，用無菌注射器及5號針頭吸取菌液，沿著靜脈平行方向刺入靜脈血管，並慢慢注入菌液，注射完畢，用幹棉球按壓住注射處，然後撥出針頭，並壓迫血管注射處片刻，以防止血液向外溢出。注射時發現注射處隆起，不易推進時，表明針尖不在血管中，應撥出針頭，重找位置再注射。有時針尖口被堵塞，菌液推不進去，應及時更換針頭。注射途徑、劑量和日程安排等視抗原和動物不同而有所不同。大腸杆菌免疫家兔的抗原注射劑量和日程安排如下表：
日期 第1日 第2日 第3日 第4日 第5日
注射劑量/mL 0.2 0.4 0.6 1.0 2.0
(2)試血：通常於最後一次注射後7~11d，從兔耳緣靜脈抽取2mL血，分離析出血清，用試管凝集反應測定抗血清效價。效價合格即可大量采血，如效價不高，可繼續注射抗原免疫，提高效價。
(3)采血：采血分為心髒采血和頸動脈放血。
心髒采血：使免疫家兔仰臥於台上，四肢固定。用左手探明心髒博動最明顯處，用碘酒棉球與酒精棉球消毒後，右手握消毒過的20mL注射器和B19號針頭，在上述部位的肋骨間隙與胸部呈45°角刺入心髒，微微抽取針筒，此時可發現血液湧入注射器中便可徐徐抽取血液。2.5kg家兔一次可取血20~30mL。取血完畢後，用消毒棉球按壓進針處迅速撥出針頭，進針處用棉球繼續壓住。並馬上將所采的血液注入無菌大試管內，斜放，待血液凝固後，置於37℃恒溫箱中30min，使血清充分析出，然後放入4~6C冰箱中。
頸動脈采血：將免疫家兔固定於兔台上，用少量乙醚麻醉，剪去頸部的毛，然後用碘酒棉球和酒精棉球消毒。沿正中線將頸部皮膚切開到鎖骨間，撥開肌膜，暴露出氣管，在氣管深側處找到搏動的頸動脈。小心地將頸動脈和迷走神經剝離分開4~5cm。用鑷子拉出頸動脈，用絲線紮緊血管的離心端，在血管的向心端用止血鉗夾住。然後用眼科剪在絲線與止血鉗之間的血管上剪一個V型小切口，將彎咀眼科鑷自切口插入，使其張開，同時將一小玻管插入，用絲線紮緊，以防玻管脫漏。玻管另一端接入一條膠管，膠管通入大試管(或大離心管)內，然後將止血鉗慢慢鬆開，使血液流入試管，直至動物死亡，無血液流出為止。
(4)抗血清分離與保存：取凝固血液於4000r/min，離心20min，獲得抗血清(即凝集素)。加入石炭酸或硫柳汞使其濃度分別達到0.5%或0.01%。測定抗血清的效價後，封好瓶口，貼好標簽，注明抗血清名稱、效價及日期，置冰箱保存備用。
(二)沉澱素的製備
抗原為可溶性抗原(如脂多糖、類毒素或可溶性蛋白等)。通常每kg兔體重注射2mg蛋白，牛血清白蛋白抗原濃度為1.5mg/mL，則2.5kg兔應注射5mg蛋白。免疫方法、采血方法和抗血清(沉澱素)的分離可參照凝集素製備方法，但效價測定則用沉澱反應來測定。
四、注意事項
由於每個動物對免疫反應不同，產生的抗體效份有高有低，所以在製備抗血清時至少免疫兩隻家兔。如須保留該免疫動物，剛采取心髒直接取血，取血後應從靜脈注射等體積的50%葡萄糖溶液，經過2~3個月的飼養，方可再次免疫。若不保留動物須一次取大量血時，則采用頸動脈放血法。
五、演示
1．耳緣靜脈注射抗原的方法。
2．心髒取血的操作過程。
六、實驗報告
1．記錄免疫家兔的操作過程及免疫過程中兔的反應。
2．實驗操作過程的體會。
七、問題和思考
1．如果不用生理鹽水來配製抗原，以這樣的抗原免疫兔成不成？為什麽？
2．現有一支蘇雲金杆菌(Bacillus thuringinesis)斜麵菌種，你能否製備出相應的凝集素？闡述其主要步驟。
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