一、實驗目的和內容
目的：學習和掌握用試管凝集反應測定抗血清效價的方法。
內容：1、玻片凝集試驗。
2、試管凝集試驗。
二、實驗材料和用具
含10億個/mL大腸杆菌(E. coli)的生理鹽水菌懸液、大腸杆菌抗血清、生理鹽水。載玻片、小試管(1cm×6.5cm)、試管架、移液管、吸管、水浴箱。
三、操作步驟
(一)玻片凝集試驗
1．在載玻片兩端各滴一滴大腸杆菌懸液。
2．在一端的菌懸液中加入一滴1：10稀釋的大腸杆菌抗血清，另一端懸液加入一滴生理鹽水。
3．將載玻片小心地振動使混合液混勻後靜置室溫中，數分鍾後便可觀察到抗血清端產生凝集塊，而另一端為生理鹽水對照。若反應不明顯，可放入培養皿中(皿內放入濕濾紙，以保持一定濕度)，37℃保溫30min後觀察結果。亦可將載玻片放置顯微鏡下，凝集塊明顯可見。
(二)試管凝集試驗
1．抗血清的稀釋 抗血清稀釋采取對倍稀釋法。取幹淨小試管10支，排列在試管架上，依次注明號碼，每支試管用移液管加入0.5mL生理鹽水。
用移液管吸取1：10稀釋的大腸杆菌抗血清0.5mL加入第1管，在管內連續吹吸3次，使血清與生理鹽水充分混合，然後吸取0.5mL加入第2管，同樣混勻後吸取0.5mL加入第3管，依次類推，直至第9管，混勻後從第9管中吸取0.5mL棄去。第10管不加血清作為對照。此時從第1管到第9管的血清稀釋倍數分別1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640，1：1280，1：2560，1：5120。
2．加入抗原 從第10支管開始，由後向前每支管依次加入0.5mL大腸杆菌菌懸液。此時血清稀釋倍數相應加大一倍。
3. 抗原抗體反應 把各管混合液振搖混勻，置37℃水浴箱中水浴4h或在室溫中過夜，觀察結果。
4．結果觀察與效價判斷
(1)生理鹽水對照管中的抗原(細菌)應分散，無凝集塊沉澱而呈混濁菌懸液。
(2)試驗管如有凝集，管底可見到凝集塊。液體上部澄清、半澄清或混濁度降低，管底凝集塊輕搖即浮起，呈片塊狀。
(3)凝集強弱的判斷(以“+”表示)
“++++”：很強，表示細菌完全凝集，凝集塊完全沉於管底，菌液澄清。
“+++”：很強，表示細菌絕大部分凝集，凝集塊小沉於管底，菌液有輕微混濁。
“++”：中等強度，表示細菌部分凝集沉於管底，凝集塊呈顆粒狀，菌液半澄清。
“+”：弱，表示細菌少數凝集，菌液混濁。
“-”：不凝集，菌液混濁與生理鹽水對照管同。
血清的效價就是呈現50%凝集(即“++”反應)的最高血清稀釋倍數。
四、注意事項
1．所用載玻片、試管、移液管等用具均應幹淨。
2．在血清對倍稀釋過程中，力求準確。一是防止液體溢出管外，二是在連續吸3次混勻液體時，第2次吸人移液管中的液體高度不能低於第1次，最好是每一稀釋度換一支洗淨的移液管。
3．試管水浴或靜置後，觀察前不宜搖動振蕩，以免影響實驗結果的準確性。
五、演示
1．對倍稀釋過程。
2．玻片凝集的顯微示範鏡，觀察凝集塊。
六、實驗報告
(一)記錄玻片凝集試驗結果，試比較血清端與生理鹽水端結果的不同，並解釋其原因。
(二)抗血清的效價測定結果。
1．抗血清效價測定結果：
2．確定抗血清的效價為 。
七、問題和思考
1．為什麽取“++”的抗血清最高稀釋倍數作為抗血清的效價？
2．在試管凝集試驗中，有否出現不正常現象？並分析其原因。
3．現有枯草孢杆菌斜麵菌種及未知效價的相應抗血清，你能否測定出其血清效價？描述其操作過程
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