非培養檢測技術在曲黴菌感染中的臨床應用進展
錄入時間:2015-6-17 11:25:42
來源：青島betway必威西汉姆联生物
曲黴在環境中廣泛存在，主要通過呼吸道吸入黴菌胞子進入人體。首先侵人感染肺部進而發肺曲黴菌病。在血液係統疾病、肺結核、慢性支氣管炎、支氣管擴張、肺癌等免疫抑製患者中曲黴已成為僅次於白念珠菌的重要致病真菌。曲黴菌感染已成為最常見的、傳播最廣的條件致病黴菌之一，但早期診斷困難，常常導致治療時機延誤，病死率高達30％一50％ 。
傳統的真菌分離、培養和組織病理鑒定等診斷方法敏感性低、陽性率低。早期、快速、簡便、敏感、特異的診斷方法是目前條件性曲黴菌感染實驗診斷研究領域的熱點。近年來，國內外相繼建立了一係列非培養的檢測技術，現綜述如下：
一、特異性抗原的檢測
1 半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM>是存在於曲黴和青黴細胞壁中的一類具有高度特異性和高度保守性的多糖，可作為曲黴菌檢測的特異性分子的標誌物。基本化學結構為B一(1，4)．苷鏈連接成的D一吡喃甘露糖為主鏈，以(It一(1，6)-苷鏈連接成的D-吡喃半乳糖構成為支鏈。每個GM上有十幾個這樣的半乳糖表位可被抗GM的單克隆抗體EB—A：識別。當曲黴菌吸入進入人體肺組織中吞噬細胞便快速將它吞噬，消化處理後釋放出真菌細胞壁結構成分。通過血清、支氣管肺泡灌洗液、尿液、腦脊液均可監測到半乳甘露聚糖。其檢測方法有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和乳膠凝集試驗(LA)等，最低檢測限度為5—10 pg／mL。其中LA和ELISA 已經商品化應用較廣泛。Kauffmann—Lacroix等 比較LA、ELISA、直接鏡檢和組織活檢各方法在診斷真菌性鼻竇炎的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值，發現直接鏡檢法檢測敏感性低，影響臨床及時的診斷與治療，組織活檢敏感性高，但臨床很難廣泛開展。Acosta 報道GM陽性結果較曲黴菌培養早4．3天。2003年美國FDAGM檢測批準血GM監測用於血液、腫瘤等免疫低下者侵襲性曲黴感染的診斷指標 J。對高危患者每周2次連續動態監測具有早期診斷價值。臨床常用試劑為美國platelia Aspergillus(Bio—Rad)GM ELISA，用ELISA(EB一2單抗，雙夾心法)的方法檢測GM(EBA一2單抗)。國內外研究多采用同樣的試劑和方法，但報道的判定界值尚不統一，主要原因是待檢人群不同，實驗條件限製以及采樣頻率等有關 。Fujiuchi S 在2001—2008年研究了1511肺部慢性疾病包括肺結核、COPD、肺間質纖維化等肺部慢性疾病患者，當GM>0．5時，敏感性63．4％ ，特異性68．6％ ；當GM>0．51時，特異性更高；美國FDA判定血
GM>0．5為陽性，歐盟判定I>0．51為陽性。目前歐美專家一致認為兩次，GM>0．5可判定陽性 J。除了血液標本支氣管肺泡灌洗液檢測GM是研究熱點，Park SY 報道了肺泡灌洗液GM包括359例患者，當BAL—GM≥0．5時其敏感性達64％ ，特異性89％ 。國外He H等 提出血聯合BALF檢測GM可提高IPA早期的診斷率，需要進一步研究證明。
GM檢測對診斷曲黴菌感染有臨床意義，但少數情況下它可出現假陽性、假陰性。假陽性與進食牛奶、應用青黴素如呱拉西林／他唑巴坦等有關。新生隱球菌的莢膜含有與GM呈交叉反應的表位，可出現假陽性。另外棘白菌素類抗真菌藥物的作用靶點為破壞真菌的細胞壁，因此在使用該類藥物後同樣出現假陽性。假陰性與抗真菌治療、病灶局部被纖維組織包裹未侵入血、組織液或與血液中的多種物質結合後使其抗原表位被封閉、體內產生高滴度GM抗體有關。
2 1，3一B．D葡聚糖抗原(G試驗) 除結合菌和隱球菌除外的所有真菌的一種特異性的細胞壁成分，監測標本為血清，其敏感性和特異性均達到80％ 。此項檢測被美國FDA和歐洲許多國家批準用於血液、腫瘤等免疫受損者中。因對定植的念珠菌顯示陰性 l 常與GM聯合監測進而提高曲黴菌感染診斷的敏感性，BG和GM均陰性基本可排除真菌感染。但血清學BDG檢測容易受到血液學及其他因素影響如纖維素類物質：手術中使用的紗布、海棉、血液透析中的纖維素膜、靜脈應用免疫球蛋白和白蛋白等。而且其在血液中可與抗體形成免疫複合物，並迅速被血液清除，造成假陰性 。
二、特異性抗體的檢測
侵襲性真菌病多為免疫受損宿主，常常缺乏可檢測到的抗體，或者抗體的產生變化較大。國外報道利用從真菌提取的天然抗原建立了多種地方性真菌病血清學檢測，包括芽生菌病、球抱子菌病、組織胞漿菌病、副球胞子菌病和毒黴病的早期診斷及流行病學調查，並顯示出較高的敏感性和特異性，在某些地方性條件性真菌感染顯示出一定的應用價值 。國內外研究曲黴菌特異性抗體均較少，敏感性和特異性較差，早期診斷價值不大。
三、特異性核酸的檢測
通過分子生物學技術特別是PCR擴增可在短時間內檢測微量的真菌DNA。臨床標本可選擇血液、尿液、BAL、腦脊液及玻璃體液，等。國外Raad等” 用PCR檢測了249例癌症患者的BAL中曲黴的線粒體和堿性磷酸酶基因，敏感性、特異性及陽性、陰性預期值分別為80％ 、93％ 、38％和99％ 。Sanguinetti 采用實時定量PCR法對4J4例IPA患者BAL中幾種睦黴菌(煙曲黴、黃曲黴、灰綠曲黴、黑曲黴和土曲黴)共有的18sRNA編碼基因上一個124bP的保守片段進行檢測敏感性90％ ，特異性100％ 。Real—timePCR可以在封閉狀態對擴增產物進行檢測，可避免擴增產物汙染而引起的假陽性結果。同時還可以結合限製性內切酶來分析區別鑒定致病菌的種屬。因此隨著實時PCR技術的完善和發展，通過監測曲黴的DNA水平實施療效監控提示預後，將大大提高PCR用於臨床係統性真菌感染早期診斷的價值。
四、特異性代謝物的檢測
檢測真菌感染代謝物D一甘露聚醇(mannito1)可用於曲黴菌感染的診斷。國外動物實驗研究報道曲黴菌D一甘露醇水平明顯高於非感染對照組 J。而國內相關報道尚未見明確報道。由於不同菌株產生代謝物能力差別較大，而且受體內代謝物及其他微生物代謝物的幹擾，檢測所需的儀器設備要求較高，目前仍處於科研階段，臨床常規應用受到限製，因此需要更大量的實驗進一步證實。
五、免疫組化
免疫組織化學是用標記的抗體或抗原對細胞或組織中的相應抗原或抗體進行定性、定位或定量檢測，經過組織化學的顯色反應舌，顯微鏡進行觀察，具有特異性、敏感性高的優點，並可將形態學和功能代謝密切結合。國外已有製備出鼠抗煙曲黴單克隆抗體，兔抗新型隱球菌及兔抗白念珠氫多克隆抗體。該方法國內外研究尚處於動物試驗階段，臨床應用未見相關報道。
非培養的曲黴菌檢測技術具有快速、簡便，敏感性、特異性高的優點，在診斷曲黴菌感染有重要的價值，為臨床早期快速診斷侵襲性曲黴菌感染帶來了希望，對及時控製病情、疾病
的預後具有重要意義。隨著對真菌基因分析和成分的深入研究，以及新的更先進檢測技術的問世，非培養的快速檢測技術，將成為曲黴菌感染實驗室診斷的重要手段。
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