二、微生物鑒定係統
前幾年，很多微生物實驗室在調研購買何種類型的微生物鑒定係統，我們實驗室的鑒定設備是使用生化方法鑒定的設備（表型鑒定），相信現在大多數的實驗室還是在使用生化方法去進行鑒定，不論使用設備或者API等手工板條進行鑒定，也有部分實驗室使用分子方法（PCR+測序）進行鑒定，但礙於方法的局限、菌庫的數量及鑒定的程度，實際檢出率和準確率都不是很理想。
《9204微生物鑒定指導原則》的內容對於現在大多數的藥企針對性和指導性都很強，其中介紹的技術包含了現在藥企實驗室可用的幾乎所有的鑒定方法，個人覺得這篇指導原則是微生物指導原則中的幹貨，指導原則中的內容就不在本文中多加贅述，以下簡單介紹一下微生物鑒定方法及微生物設備的選型。
1、鑒定方法簡介
微生物鑒定原則：表觀水平→生化水平→分子水平，微生物鑒定應遵循逐步縮小範圍的原則，依據分類學知識，將微生物逐步落實到科、屬、種。
各類微生物的菌落特征就不在這裏列表了，在很多微生物書籍中均有介紹，進行微生物鑒定的人員應對各類型微生物的形態特征做到心中有數。不管使用何種方法進行微生物鑒定，都應對微生物進行純化，至少分離到純培養物後再進行後續鑒定。
現有的鑒定技術分為表型鑒定、基因型鑒定和色譜光譜鑒定。表型鑒定基於表觀生物學活性，如營養物質代謝試驗、碳源和氮源利用試驗、各種酶類試驗、API試驗條等；基因型鑒定基於核酸物質，如16SrRNA分型、核糖體分型和脈衝場電泳試驗；色譜光譜鑒定基於全細胞信息，如傅裏葉變換紅外技術。
1） 初篩試驗
流程基本就是分離純化→革蘭氏染色（芽孢染色、KOH拉絲試驗）→生化篩選（氧化酶、觸酶、凝固酶）→根據上述結果篩選板條→孵育規定時間人工讀數或機器讀數→結果對比係統中的標準微生物特征得出鑒定結論。
革蘭氏染色鏡檢對於鑒定人員的技術及判斷經驗有一定要求，這步是很關鍵的一步，但這個沒有捷徑必須是多做才能總結經驗的，很多時候一些球杆菌、芽孢菌等的形態和染色結果均依賴鏡檢人員的經驗，有些在無法判斷的情況下，可以使用KOH拉絲實驗進行輔助判斷，但我們實驗室不用其判定革蘭氏染色結果，大多數革蘭氏陰性菌在5-10S內出現陽性反應，有的則需30-45S，假單胞菌、無色杆菌、黃杆菌、產堿杆菌等大多數在10S內呈陽性，不動杆菌、莫拉菌反應較慢，大多數菌株在60S內出現陽性，而革蘭氏陽性菌在60S以後仍為陰性，其主要用於革蘭氏陰性菌與易脫色的革蘭氏陽性菌的鑒別。
生化篩選中的三種方法，氧化酶試驗是將革蘭氏陰性杆菌分為非發酵菌（如假單胞菌）及腸道菌（如腸杆菌科）；觸酶試驗，也叫過氧化氫酶試驗，用於革蘭氏陽性球菌的鑒別，葡萄球菌和微球菌呈陽性反應，鏈球菌及腸球菌呈陽性反應，但是需要注意的是腸球菌多假陽性情況；凝固酶試驗，區分致病性及非致病性葡萄球菌，金黃色葡萄球菌多陽性。
初篩試驗是鑒定的最關鍵步驟，若結果錯誤會影響後續試驗，包括微生物鑒定試劑盒和引物的選用。
2）表型鑒定
這裏必須介紹下生化鑒定的始祖API試條，這個相信很多實驗室還在使用，是全手工的方法，流程是接種物的製備（以上的生化鑒定全部完成）→試驗條的篩選（根據之前生化鑒定結果選擇）→試驗條的接種→試驗條的判讀。這個方法其實很多實驗室即使買了設備也沒法擯棄，如果設備壞了還是需要手工方法進行試驗，成本相對低廉，15種試條可鑒定細菌550種，但是人工判讀結果的有較大誤差（看色判讀），也是需要相當經驗值，我們實驗室如果碰到判讀有異議，一般會由2人一起對結果進行判斷，達成一致後再輸入鑒定結果。
表型微生物鑒定太依賴於其本身的表型特征，實驗室很多時候在初次鑒定時的結果並不理想，在二次鑒定時得出可接受的鑒定結果，從初始培養物中剛分離出的受損的次代培養物可能不能進行完整的基因表達。
在指導原則中提到“表型微生物鑒定方法已廣泛應用於藥品微生物實驗室，根據微生物表型鑒定所提供的信息可以判斷藥品中汙染的微生物種類，也可掌握環境微生物菌群的變化，並進行產品的風險評估。在許多質量控製調查中，單獨的表型鑒定結果就能給出充足的信息幫助調查人員進行深入調查，並按需要製定適宜的糾正措施。”該類鑒定方法雖有一定局限性，但是是最常用的鑒定方法。
3）基因鑒定
基因相較於表型來說差異相對比較少見，且基因型的明顯差異說明其並非同種或同屬，理論上，基因型微生物因核酸序列高度保守所以其鑒定結果更可靠，其通常不受生長培養基等的影響，隻需分離到純菌落便可用於分析。
最常用的方法就是通過比較細菌16SrRNA或真菌8SrRNA基因的部分堿基序列來實現，即經過PCR進行基因擴增、電泳分離擴增產物、以雙脫氧鏈終止法進行堿基測序，然後與數據庫進行比對，有的微生物實驗室直接使用該方法進行鑒定。我們實驗室也正在進行生化鑒定和該方法的比較試驗，日常使用生化方法，關鍵事件的調查準備兩者結合使用或委外使用色譜方法進行綜合鑒定。
當然，基因型鑒定雖然比表型鑒定的準確率和檢出率會有一定提高，但是基因型數據也有一定的局限性。鑒定係統同樣不能鑒定所有的微生物；需要昂貴的分析設備和耗材；通常僅有關鍵的微生物調查才會應用；僅憑基因型數據作出的決定，對於考慮微生物特征，測試曆史及微生物來源是沒有意義的；當今伯傑氏手冊中的分類學手段基於遺傳物質並非遵循表觀水平，導致一些已知的微生物分類學發生改變及重命名（如黑曲黴ATCC16404）。
在指導原則中提到 “基因鑒定法不但技術水平需要保證，還需要昂貴的分析設備和材料，通常僅在關鍵微生物調查中使用，如產品不合格調查。若使用，方法必須經過確認。”所以若使用基因鑒定的方法一定要進行方法確認，確認的方法在指導原則中有詳細描述。
2、設備選型
在選擇是否購買設備、買何種設備前，必須了解各類鑒定原理。很多人會問哪個技術更好，越是後端發展的技術越是鑒定的準確那是無疑的，而且有些設備可以進行溯源調查，這也是大家對於OOS結果調查中希望開發的模塊，當然傳統的生化也不用摒棄，可以結合一些表型鑒定對鑒定結果進行分析和判斷。
設備選型至少應考慮以下幾點：預算、設備菌庫量、設備一次最大檢驗量、檢驗時間、檢驗過程複雜性、檢驗結果溯源性、做1TEST的成本、設備的維護成本等，以下挑重點項討論。
預算的多少其實直接決定了選擇哪個鑒定原理的設備，現有鑒定儀器的實驗室基本買的都是表型鑒定設備，價格比較能夠接受，其他方法設備相對較昂貴，有溯源功能的設備價格更甚，後續的實驗成本也不便宜。企業可以根據預算量進行考慮，但是基因及色譜光譜法一定是菌鑒發展的趨勢。
菌庫量是必須要考慮的問題，很多設備的銷售會對外宣傳他們設備的菌庫量很大，聽到這樣的介紹我們先要冷靜，先確定其菌庫是否是指臨床的菌庫，因為在藥企的生產車間汙染的菌很多和臨床是不一樣的，我們藥企應至少偏向於工業微生物的菌庫，如果不清楚如何區分，還有個簡單的也是在購買前必須要做的試機過程，就是將自己環境菌庫中的已知微生物讓他們上機進行鑒定，特別是有些生長緩慢或當初鑒定時就比較難鑒定的菌株，如一些非發酵菌、棒狀杆菌等，比較鑒定結果。同時有些設備的菌庫會定期進行更新，應提前詢問好供應商菌庫更新的附加成本是多少，以便於及時補充菌庫量。
檢驗的複雜性、時間、一次檢驗量及其成本是設備日常使用過程中的重要參考項。如檢驗的複雜性是指人員手工需要處理樣本及上樣的時間，人工參與的時間越多結果的不可控性就越高，全自動設備的好處即在於減少人為操作的步驟和時間，當然對於一些使用生化鑒定原理的設備，如有的4-8小時即出結果，但有些非發酵菌生長緩慢，可能就會影響其鑒定結果。
購買鑒定設備細節較多，還是要根據各自企業的現狀進行篩選並在URS上寫清，若無預算也可使用API手工試條進行鑒定。
三、其他設備
藥典升級後一些常用設備需要增加，特別是培養箱等，本次很多培養溫度均進行了調整，需要考慮培養箱確認及日常校準溫度點的調整，如微生物限度黴菌及酵母菌總數溫度、控製菌中大腸埃希菌使用溫度等。
還有就是生物安全櫃的增加，如鑒定需要，還有就是中檢所的老師也推薦微生物限度使用生物安全櫃，處於既保護檢品又保護人員的考量，這也是企業可以考慮的一點。
微生物的輔助設備這次也可以一並考慮，如自動菌落計數器等可以幫助提高實驗效率的儀器。
本次藥典升級帶來的設備升級或新增對於微生物實驗室是一次不小的挑戰，但也是與國際藥典接軌的非常重要的一步，我們微生物實驗室也不應滿足現有的傳統試驗方法，應多了解和接觸一些前沿設備，如微生物快速檢驗設備等，將微生物的檢驗技術不斷推進。
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