1 範圍
本標準規定了食品中產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）的檢驗方法。
本標準適用於食品中產氣莢膜梭菌的檢驗。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
a） 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃；
b） 冰箱：2 ℃～5℃；
c） 恒溫水浴箱：50℃±1 ℃，46℃±0.5℃；
d） 天平：感量0.1 g；
e） 均質器；
f） 顯微鏡：10×～100×；
g） 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；
h） 無菌試管：18mm×180mm；
i） 無菌培養皿：直徑90 mm；
j） pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙；
k） 厭氧培養裝置。
3 培養基和試劑
3.1 胰腖-亞硫酸鹽-環絲氨酸（TSC）瓊脂：見附錄A 中A.1。
3.2 液體硫乙醇酸鹽培養基（FTG）：見附錄A 中A.2。
3.3 緩衝動力-硝酸鹽培養基：見附錄A 中A.3。
3.4 乳糖-明膠培養基：見附錄A 中A.4。
3.5 含鐵牛乳培養基：見附錄A 中A.5。
3.6 0.1%蛋白腖水：見附錄A 中A.6。
3.7 革蘭氏染色液：見附錄A 中A.7。
3.8 硝酸鹽還原試劑：見附錄A 中A.8。
3.9 緩衝甘油-氯化鈉溶液：見附錄A 中A.9。
4 檢驗程序
產氣莢膜梭菌檢驗程序見圖1。
5 操作步驟
5.1 樣品製備
5.1.1 樣品采集後應盡快檢驗，若不能及時檢驗，可在2 ℃～5 ℃保存；如8 h 內不能進行檢驗，應以
無菌操作稱取25 g（mL）樣品加入等量緩衝甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應加雙料），並盡快至於-60 ℃
低溫冰箱中冷凍保存或加幹冰保存。
5.1.2 以無菌操作稱取25 g（mL）樣品放入含有225 mL 0.1%蛋白腖水（如為5.1.1 中冷凍保存樣品，
室溫解凍後，加入200 mL 0.1%蛋白腖水）的均質袋中，在拍擊式均質器上連續均質1 min～2 min；或
置於盛有225 mL0.1%蛋白腖水的均質杯中，8 000 r/min～10 000 r/min 均質1min～2 min，作為1:10 稀釋
液。
5.1.3 以上述1:10 稀釋液按1 mL 加0.1%蛋白腖水9 mL 製備10-2～10-6 的係列稀釋液。
5.2 培養
5.2.1 吸取各稀釋液1 mL 加入無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平行。每個平皿傾注冷卻至50 ℃的TSC
瓊脂（可放置於50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）15 mL，緩慢旋轉平皿，使稀釋液和瓊脂充分混勻。
5.2.2 上述瓊脂平板凝固後，再加10 mL 冷卻至50 ℃的TSC 瓊脂（可放置於50 ℃±1 ℃恒溫水浴箱
中保溫）均勻覆蓋平板表層。
5.2.3 待瓊脂凝固後，正置於厭氧培養裝置內，36 ℃±1 ℃培養20 h～24 h。
5.2.4 典型的產氣莢膜梭菌在TSC 瓊脂平板上為黑色菌落。
5.3 確證試驗
5.3.1 從單個平板上任選5 個（小於5 個全選）黑色菌落，分別接種到FTG 培養基，36 ℃±1 ℃培養
18 h～24 h。
5.3.2 用上述培養液塗片，革蘭氏染色鏡檢並觀察其純度。產氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的杆菌，有
時可見芽孢體。如果培養液不純，應劃線接種TSC 瓊脂平板進行分純，36 ℃±1 ℃厭氧培養20 h～24 h，
挑取單個典型黑色菌落接種到FTG 培養基，36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h，用於後續的確證試驗。
5.3.3 取生長旺盛的FTG 培養液1 mL 接種於含鐵牛乳培養基，在46 ℃±0.5 ℃水浴中培養2 h 後，每
小時觀察一次有無“暴烈發酵”現象，該現象的特點是乳凝結物破碎後快速形成海綿樣物質，通常會上
升到培養基表麵。5 h 內不發酵者為陰性。產氣莢膜梭菌發酵乳糖，凝固酪蛋白並大量產氣，呈“暴烈發
酵”現象，但培養基不變黑。
5.3.4 用接種環（針）取FTG 培養液穿刺接種緩衝動力-硝酸鹽培養基，於36 ℃±1 ℃培養24 h。在透
射光下檢查細菌沿穿刺線的生長情況，判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長，無動力的菌
株隻沿穿刺線生長。然後滴加0.5 mL 試劑甲和0.2 mL 試劑乙以檢查亞硝酸鹽的存在。15 min 內出現紅
色者，表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽；如果不出現顏色變化，則加少許鋅粉，放置10 min，出現紅色者，
表明該菌株不能還原硝酸鹽。產氣莢膜梭菌無動力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。
5.3.5 用接種環（針）取FTG 培養液穿刺接種乳糖-明膠培養基，於36 ℃±1 ℃培養24 h，觀察結果。
如發現產氣和培養基由紅變黃，表明乳糖被發酵並產酸。將試管於5 ℃左右放置1 h，檢查明膠液化情況。
如果培養基是固態，於36 ℃±1 ℃再培養24 h，重複檢查明膠是否液化。產氣莢膜梭菌能發酵乳糖，使
明膠液化。
6 結果與報告
6.1 典型菌落計數
選取典型菌落數在20 CFU～200 CFU 之間的平板，計數典型菌落數。如果：
a) 隻有一個稀釋度平板的典型菌落數在20CFU～200CFU 之間，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
b）最低稀釋度平板的典型菌落數均小於20 CFU，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
c）某一稀釋度平板的典型菌落數均大於200 CFU，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數該稀
釋度平板上的典型菌落；
d）某一稀釋度平板的典型菌落數均大於200 CFU，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的
典型菌落數不在20 CFU～200 CFU 之間，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
e）2 個連續稀釋度平板的典型菌落數均在20CFU～200CFU 之間，分別計數2 個稀釋度平板上的典
型菌落。
6.2 結果計算
6.1 計數結果按公式（1）計算：
式中：
T——樣品中產氣莢膜梭菌的菌落數；
A——單個平板上典型菌落數；
B——單個平板上經確證試驗為產氣莢膜梭菌的菌落數；
C——單個平板上用於確證試驗的菌落數；
n1 ——第一稀釋度（低稀釋倍數）經確證試驗有產氣莢膜梭菌的平板個數；
n2 ——第二稀釋度（高稀釋倍數）經確證試驗有產氣莢膜梭菌的平板個數；
0.1——稀釋係數；
d——稀釋因子（第一稀釋度）。
6.3 報告
根據TSC 瓊脂平板上產氣莢膜梭菌的典型菌落數，按照6.2 中公式計算，報告每g（mL）樣品中產
氣莢膜梭菌數，報告單位以CFU/ g（mL）表示；如T 值為0，則以小於1 乘以最低稀釋倍數報告。
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