1 範圍
本標準規定了食品中雙歧杆菌（Bifidobacterium ）的鑒定方法。
本標準適用於食品中雙歧杆菌的鑒定。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
a） 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃；
b） 氣相色譜儀配FID 檢測器；
c） 冰箱：2 ℃～5 ℃；
d） 天平： 感量0.1 g；
e） 無菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm；
f） 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器（200 μL~1000 μL）及配套吸頭；
g） 無菌錐形瓶：500 mL、250 mL。
3 培養基和試劑
3.1 雙歧杆菌培養基：見附錄A 中的A.1。
3.2 PYG 液體培養基：見附錄A 中的A.2。
3.3 甲醇：分析純。
3.4 三氯甲烷：分析純。
3.5 硫酸：分析純（體積比）。
3.6 冰乙酸：分析純（體積比）。
3.7 乳酸：分析純。
3.8 乙酸標準溶液：吸取分析純冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標定，標定方法見附錄B，此溶液濃度約為1 mol/L。
3.9 乙酸標準使用液：將經標定的乙酸標準溶液用水稀釋至0.01 mol/L。
3.10 乳酸標準溶液：吸取分析純乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標定，標定方法見附錄B，此溶液濃度約為1 mol/L。
3.11 乳酸標準使用液：將經標定的乳酸標準溶液用水稀釋至0.01 mol/L。
4 鑒定程序
雙歧杆菌鑒定程序見圖1。
5 操作步驟
5.1 樣品製備
5.1.1 樣品的全部製備過程均應遵循無菌操作程序。
5.1.2 以無菌操作稱取25 g（mL）樣品，置於裝有225 mL 生理鹽水的滅菌錐形瓶內，製成1:10 的樣品勻
液。
5.2 稀釋及塗布培養步驟
5.2.1 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1.0 mL，沿管壁緩慢注於裝有9 mL 生理鹽水的
無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1 支無菌吸管反複吹打使其混合均勻，製
成1:100 的樣品勻液。
5.2.2 另取1 mL 無菌吸管或微量移液器吸頭，按5.2.1 操作順序，做10 倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一
次，即換用1 次1 mL 滅菌吸管或吸頭。
5.2.3 根據待鑒定菌種的活菌數，選擇三個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1 mL 稀釋液，用L 棒
在雙歧杆菌瓊脂平板進行表麵塗布, 每個稀釋度作兩個平皿。置36 ℃±1 ℃ 溫箱內培養48 h±2 h，培養後
選取單個菌落進行純培養。
5.3 純培養
挑取3 個或以上的菌落接種於雙歧杆菌瓊脂平板，厭氧，36 ℃±1 ℃ 培養48 h。
5.4 鏡檢及生化鑒定
5.4.1 塗片鏡檢
雙歧杆菌菌體為革蘭氏染色陽性，不抗酸、無芽孢，無動力，菌體形態多樣，呈短杆狀、纖細杆狀或
球形，可形成各種分支或分叉形態。
5.4.2 生化鑒定
過氧化氫酶試驗為陰性。選取純培養平板上的三個單個菌落，分別進行生化反應檢測，不同雙歧杆菌
菌種主要生化反應見附錄B。
5.5 有機酸代謝產物測定
氣相色譜法測定雙歧杆菌的有機酸代謝產物, 見附錄C。
6 報告
根據鏡檢及生化鑒定的結果（5.4）、雙歧杆菌的有機酸代謝產物乙酸與乳酸微摩爾之比大於1（5.5），
報告雙歧杆菌屬的種名。
附錄 A
培養基
A.1 雙歧杆菌瓊脂培養基
A.1.1 成分
蛋白腖 15.0 g
酵母浸膏 2.0 g
葡萄糖 20.0 g
可溶性澱粉 0.5 g
氯化鈉 5.0 g
西紅柿浸出液 400.0 mL
吐溫80 1.0 mL
肝粉 0.3 g
瓊脂粉 15.0 g～20.0 g
加蒸餾水至 1 000.0 mL
A.1.2 製法
A.1.2.1 半胱氨酸鹽溶液
稱取半胱氨酸0.5 g，加入1.0 mL 鹽酸，使半胱氨酸全部溶解，配製成半胱氨酸鹽溶液。
A.1.2.2 西紅柿浸出液
將新鮮的西紅柿洗淨後稱重切碎，加等量的蒸餾水在100 ℃水浴中加熱，攪拌90 min，然後用紗布過濾，校正pH7.0，將浸出液分裝後，121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。
A.1.2.3 培養基
將A.1.1 所有成分加入蒸餾水中，加熱溶解, 然後加入半胱氨酸鹽溶液，校正pH 6.8±0.2。分裝後121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。臨用時加熱熔化瓊脂，冷至50 ℃時使用。
A.2 PYG 液體培養基
A.2.1 成分
蛋白腖 10.0 g
葡萄糖 2.5 g
酵母粉 5.0 g
半胱氨酸-HCl 0.25 g
鹽溶液 20.0 mL
維生素K1 溶液 0.5 mL
氯化血紅素溶液5mg/mL 2.5 mL
加蒸餾水至 500.0 mL
A.2.2 製法
A.2.2.1 鹽溶液
稱取無水氯化鈣0.2 g，硫酸鎂0.2 g，磷酸氫二鉀1.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，碳酸氫鈉10.0 g，氯化鈉2.0 g，加蒸餾水至1000 mL。
A.2.2.2 氯化血紅素溶液（5mg/mL）
稱取氯化血紅素0.5 g 溶於1 mol/L 氫氧化鈉1.0 mL 中，加蒸餾水至1000 mL，121 ℃高壓滅菌15min～20 min。
A.2.2.3 維生素K1溶液
稱取維生素K11.0 g，加無水乙醇99 mL，過濾除菌，冷藏保存。
A.2.2.4 培養基
除氯化血紅素溶液和維生素K1 溶液外，A.2.1 其餘成分加入蒸餾水中，加熱溶解，校正pH6.0，加入中性紅溶液。分裝後121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。臨用時加熱熔化瓊脂，加入氯化血紅素溶液和維生素K1 溶液，冷至50 ℃使用。
附錄 B
雙歧杆菌菌種主要生化反應
雙歧杆菌菌種主要生化反應見表B.1。
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