範圍
本標準規定了食品中大腸菌群的快速檢驗和計數方法。
本標準適用於食品中大腸菌群的快速檢驗和計數。
規範性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用於本標準。
GB 4 78 9.3 食品衛生微生物學檢驗大腸菌群測定
GB 4 78 9.28 食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑
ISO 4 83 2:1991(E) 微生物學— 大腸菌群菌落計數法通則
術語和定義
下 列 術 語和定義適用於本標準
3.1
大腸菌群coliform bacteria
大腸菌群是革蘭氏陰性、無芽抱、氧化酶陰性的杆狀細菌，為需氧和兼性厭氧，可在有膽鹽(或具有其他抑製生長的表麵活性劑)存在的情況下生長，通常可在36℃士2℃發酵乳糖並產酸和醛。具有件半乳糖昔酶。在本標準設定的條件下，大腸菌群為能分解R-半乳糖昔、使培養基發出熒光或生成紫色(或紅色)菌落的一群革蘭氏陰性無芽抱杆菌。
4 原理
4.1 最可能數(MPN)法
大 腸 菌 群可產生各半乳糖昔酶，分解液體培養基中的酶底物—4一甲基傘形酮一各D一半乳糖普(以下簡稱MUGaD，使4一甲基傘形酮遊離，因而，在波長366 nm的紫外光燈照射下呈現藍色熒光。
4.2 平板法
大腸菌群可產生件半乳糖昔酶，分解培養基中的酶底物— 茜素一份D-半乳糖昔(以下簡稱Alizgal)，使茜素遊離並與固體培養基中的鋁、鉀、鐵、錢離子結合形成紫色(或紅色)的鼇合物，使菌落呈現相應的顏色。
試劑和培養基
5.1 磷酸鹽緩衝液
按 GB 4 789.28-1994中3.22規定進行製備。
5.2 生理鹽水
5.2.1 成分
氯化鈉 8.5g
蒸 餾 水 10 00m L
5.2.2 製法
將氯化鈉溶於蒸餾水，121'C蒸汽滅菌15m in,
5.3 MUGal肉湯
5.3.1 成分
胰蛋白腖或胰酪腖20.0 g
氯化鈉 5.0 g
無水磷酸氫二鉀2.75 g
無水磷酸二氫鉀2.75 g
月桂基硫酸鈉0.1g
MU G .I (純度不低於99%) 0. 08 g
蒸餾水 1000m L
5.3.2 製法
將各成分加熱溶於蒸餾水中，以15% 20腸氫氧化鈉溶液調整pH值，分裝於20m mX 1 50m m試管，每管9 mL,116"C蒸汽滅菌10 min，最終pH值7.0-7.2。待培養基冷卻後，以無菌手續於每管培養液內加人0.1 m L經無菌水稀釋的500p g/mL頭抱磺徒液或於10 00m L滅菌培養液內加1m L經無菌水稀釋的5 mg/mL頭抱磺吮液並以無菌操作分裝試管。
注 :雙 料 MUGal肉湯除燕餾水外，其他成分加倍。
5.4 Aliz-gal瓊脂
5.4.1 成分
胰蛋白腖或胰酪腖20.0 g
氯化鈉 5.0 g
無水磷酸氫二鉀2.75 g
無水磷酸二氫鉀2.75 g
月桂基硫酸鈉0.1g
Aliz-gal (純度不低於97寫) 0.05 g
異丙基硫代半乳糖昔0.03g
硫酸鋁鉀 0.5 g
檸檬酸鐵錢0.5 g
瓊脂 15.0 g
蒸餾水 1000m L
5.4.2 製法
將各成分放入蒸餾水中，加熱使溶化，以15%~ 2 0%NaOH調整pH值，分裝燒瓶,1160C燕汽滅菌10m in，最終pH值7.0-7.2
6 設備和器材
培養箱:37℃士10℃
冷藏箱:0℃士4℃
天平:感量0.01 g
均質器或乳缽。
平皿:直徑90 mm,
試管:20 mm ×150 mm.
吸管:1.0 ml一和10.0 ml。
廣口瓶或三角瓶:容量500 ml
玻璃珠:直徑約5 mm
試管架
紫外燈(波長366 nm)
其 他
7檢驗程序
8 樣品的製備
8.1 以無菌手續取25 mL(或25 g)樣品，加於含225 mL無菌磷酸鹽緩衝液(或生理鹽水)的廣口瓶
(或三角瓶)內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)，充分振搖或用均質器以8000r/m-10000 r/m均質1 min成1：10稀釋液。
8.2 用1m L無菌吸管吸取1，10樣品稀釋液1.0 m L，注人含9.0 m L無菌磷酸鹽緩衝液(或生理鹽水)的試管內，振搖均勻，即成1，10。樣品稀釋液。
8.3 另取1. 0 mL無菌吸管，按上法製備10倍遞增樣品稀釋液。每遞增一次，換一支1. 0 mL無菌吸管。
8.4 根據食品衛生標準要求或對樣品汙染程度的估計，選擇三個適宜的連續稀釋度，每個稀釋度接種三管培養基(MPN 法)或兩個平皿(平板法)。
9 大腸菌群的MPN計數
9.1 將待檢樣品和樣品稀釋液接種MUGal肉湯管，每管1. 0 mL(接種量在1. 0 mL以上者，接種雙料MUGal肉湯管)。每個樣品接種三個連續稀釋度，每個稀釋度接種3管培養基。同時另取2支MUGal肉湯管(或雙料MUGal肉湯管)加人與樣品稀釋液等量的上述無菌磷酸鹽緩衝液(或生理鹽水)作空白對照。
9.2 將接種後的培養管置於3TC士1'C培養箱培養18 h-24 h
9.3 將培養管置於暗處，用波長366 nm的紫外光燈照射，如顯藍色熒光，為大腸菌群陽性管;如未顯藍色熒光，則為大腸菌群陰性管。
9.4 結果報告:根據大腸菌群陽性管數，查MPN表(見附錄A)，報告每100 m工(g)食品中大腸菌群MPN值。
10 大腸菌群的菌落計數
10.1 用滅菌吸管吸取待檢樣液1. 0 mL，加人無菌平皿內。每個樣品接種三個連續稀釋度，每個稀釋度接種兩個平皿。
10.2 於每個加樣平皿內傾注巧mL45 C~ 50℃的Aiiz-gal瓊脂，迅速輕輕轉動平皿，使混合均勻。待瓊脂凝固後，再傾注3 mL-5 mL Aliz-gal瓊脂覆蓋表麵。同時將Aliz-gal瓊脂傾人加有1 mL上述無菌磷酸鹽緩衝液(或生理鹽水)的無菌平皿內作空白對照。
10.3 待瓊脂凝固後，翻轉平板，於37℃士1'C培養箱培養18 h-24 h。取出平板，計數紫色(或紅色)菌落。
10.4 結果報告
10-4.1 當平板上的紫色(或紅色)菌落數不高於150個，且其中至少有一個平板紫色(或紅色)菌落不少於15個時，按式(1)計算大腸菌群數：N=∑C/(n1+n2)d
式 中 :
N — 樣品的大腸菌群數，個/mL或g;
∑C — 所有計數平板上，紫色(或紅色)菌落數之總和;
n1 — 供計數的最低稀釋倍數的平板數;
n2 — 供計數的高一稀釋倍數的平板數;
d— 供計數的樣品最低稀釋度(如10-1,10-2,10-3等)
10.4.2 如接種所有(3個)稀釋樣品的平板上，紫色(或紅色)菌落數均少於15個時，仍按式(1)計算，但應在所得結果旁加“‘”號，表示為估計值。
10.4.3 如接種未稀釋樣品和所有稀釋樣品的平板上，紫色(或紅色)菌落數均少於15個時，報告結果為:每毫升(克)樣品少於15個大腸菌群。
10.4.4 如接種未稀釋樣品和所有稀釋樣品的平板上，均未發現紫色(或紅色)菌落數時，報告結果為:每毫升(克)樣品少於1個大腸菌群。
10.4.5 如平板上的紫色(或紅色)菌落數高於15個時，按式(1)計算，在結果旁加“，”號表示估計值或視情況重新選擇較高的稀釋倍數進行測定。
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