000011 範圍
本標準規定了食品中凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢驗方法。
本標準第一法適用於食品中凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌的定性檢驗；第二法適用於金黃色葡萄球菌含量較高的食品中凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌的計數；第三法適用於金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌的計數。
2 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
2.1 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 恒溫水浴箱：37 ℃～65 ℃。
2.4 天平：感量0.1 g。
2.5 均質器。
2.6 振蕩器。
2.7 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。
2.8 無菌錐形瓶：容量100 mL、500 mL。
2.9 無菌培養皿：直徑90 mm。
2.10 L塗布棒。
2.11 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。
3 培養基和試劑
3.1 7.5 %氯化鈉肉湯：見附錄A 中A.1。
3.2 血瓊脂平板：見附錄A 中A.2。
3.3 Baird-Parker 瓊脂平板：見附錄A 中A.3。
3.4 兔血漿纖維蛋白原（RPF）瓊脂培養基：見附錄A 中A.4。
3.5 腦心浸出液肉湯(BHI) ：見附錄A 中A.5。
3.6 兔血漿：見附錄A 中A.6。
3.7 稀釋液：磷酸鹽緩衝液：見附錄A 中A.7。
3.8 營養瓊脂小斜麵：見附錄A 中A.8。
3.9 革蘭氏染色液：見附錄A 中A.9。
3.10 無菌生理鹽水：見附錄A 中A.10。
第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗
4 檢驗程序
金黃色葡萄球菌定性檢驗程序見圖1。
5 操作步驟
5.1 樣品的處理
稱取25 g 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯的無菌均質杯內，8000 r/min～10000 r/min 均質1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min。若樣品為液態，吸取25 mL 樣品至盛有225 mL 7.5 %氯化鈉肉湯的無菌錐形瓶(瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻。
5.2 增菌和分離培養
5.2.1 增菌
5.2.1.1 將上述樣品勻液於36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生
長。
5.2.1.2 將上述培養物，分別劃線接種到Baird-Parker 平板（a法）或RPF平板（b法），培養24 h。如果菌落不典型，可繼續培養至48h觀察。
5.2.2 分離培養
5.2.2.1 a法：金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上呈圓形,表麵光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉澱),其外常有-清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣粘稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質地較幹燥。挑取上述可疑菌落進行鑒定（見5.3.1、5.3.2、5.3.3）。
5.2.2.2 b法：金黃色葡萄球菌在RPF平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外圍有沉澱暈環。挑取上述可疑菌落進行鑒定（見5.3.1、5.3.2）。
5.3 鑒定
5.3.1 染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為
0.5 μm～1 μm。
5.3.2 溶血試驗：挑取Baird-Parker 平板或RPF平板上可疑菌落1 個或以上，分別劃線接種到血平板上純培養，36 ℃±1 ℃，18 h～24h。
觀察菌落溶血情況，金黃色葡萄球菌在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。
5.3.3 血漿凝固酶試驗：挑取Baird-Parker 平板上可疑菌落1 個或以上，分別接種到5 mL BHI和營養瓊脂小斜麵，36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。
取新鮮配置兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI 培養物0.2 mL～0.3 mL，振蕩搖勻，置36
℃±1 ℃溫箱或水浴箱內，每半小時觀察一次，觀察6 h，如呈現凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現凝
塊）或凝固體積大於原體積的一半，被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌
株的肉湯培養物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進行血漿凝固酶試驗。
結果如可疑，挑取營養瓊脂小斜麵的菌落到5 mL BHI，36 ℃±1 ℃培養18 h～48 h，重複試驗。
5.4 葡萄球菌腸毒素的檢驗（選做）
可疑食物中毒樣品或產生葡萄球菌腸毒素的金黃色葡萄球菌菌株的鑒定，應按附錄B檢測葡萄球菌
腸毒素。
6 結果與報告
6.1 結果判定：
6.1.1 Baird-Parker 平板（a法）上的可疑菌落符合5.3.1、5.3.2、5.3.3，可判定為金黃色葡萄球菌。
6.1.2 RPF平板（b法）上可疑菌落符合5.3.1、5.3.2，可判定為金黃色葡萄球菌。
6.2 結果報告：在25 g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。
第二法 金黃色葡萄球菌平板計數法
7 檢驗程序
金黃色葡萄球菌平板計數法程序見圖2。
8操作步驟
8.1 樣品的稀釋
8.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000 r/min～10000 r/min均質1 min～2 min，或置盛有225 mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min，製成1:10的樣品勻液。
8.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，製成1:10的樣品勻液。
8.1.3 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注於盛有9 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵），振搖試管或換用1支1 mL無菌吸管反複吹打使其混合均勻，製成1:100的樣品勻液。
8.1.4 按8.1.3操作程序，製備10倍係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無菌吸管或吸頭。
8.2 接種、培養
8.2.1 Baird-Parker平板計數法
8.2.1.1 接種
根據對樣品汙染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別加入三塊Baird-Parker平板，然後用無菌L棒塗布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如Baird-Parker平板表麵有水珠，可放在25 ℃～50 ℃的培養箱裏幹燥，直到平板表麵的水珠消失。
8.2.1.2 培養
在通常情況下，塗布後，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱36 ℃±1 ℃培養1 h；等樣品勻液吸收後翻轉平皿，倒置於培養箱，36 ℃±1 ℃培養，45 h～48 h。
8.2.2 RPF平板計數法：
8.2.2.1 接種
根據對樣品汙染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10 倍遞增稀釋時，吸取1 mL 樣品勻液於無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，吸取1 mL 空白稀釋液加入無菌平皿內作空白對照。
8.2.2.2 培養
及時將15 mL～20 mL 冷卻至46 ℃的RPF瓊脂培養基（可放置於46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，並轉動平皿使其混合均勻。 待瓊脂凝固後，翻轉平板，置３６ ℃±１ ℃培養箱，培養２４ｈ～４８ｈ。
8.3典型菌落計數和確認
8.3.1 金黃色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上呈圓形,表麵光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2 mm～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉澱),其外常有-清晰帶。當用接種針觸及菌落時具有黃油樣粘稠感。有時可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質地較幹燥。
8.3.2 金黃色葡萄球菌在RPF平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外圍有沉澱暈環。
8.3.3 選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度3 個平板所有菌落數合計在20 CFU～200 CFU 之間的平板，計數典型菌落數。如果：
a） 如果隻有一個稀釋度平板的菌落數在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板
上的典型菌落；
b） 最低稀釋度平板的菌落數小於20 CFU 且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
c） 某一稀釋度平板的菌落數大於200 CFU 且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，
應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
d） 某一稀釋度平板的菌落數大於200 CFU 且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但
其平板上的菌落數不在20 CFU～200 CFU 之間，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
以上按公式（1）計算。
e） 2 個連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～200 CFU 之間且有典型菌落，按公式（2）計算。
8.3.4 從典型菌落中任選5個菌落（小於5個全選），分別按5.3.1、5.3.2做鑒定試驗；Baird-Parker 平板上的典型菌落還要做血漿凝固酶試驗。
9 結果計算
公式（1）：
………………………………………………………………… （1）
式中：
T——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數；
A——某一稀釋度典型菌落的總數；
B——某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數；
C——某一稀釋度用於鑒定試驗的菌落數；
d——稀釋因子。
公式（2）：
………………………（2）
式中：
T ——樣品中金黃色葡萄球菌菌落數；
A1——第一稀釋度（低稀釋倍數）典型菌落的總數；
A2——第二稀釋度（高稀釋倍數）典型菌落的總數；
B1——第一稀釋度（低稀釋倍數）鑒定為陽性的菌落數；
B2——第二稀釋度（高稀釋倍數）鑒定為陽性的菌落數；
C1——第一稀釋度（低稀釋倍數）用於鑒定試驗的菌落數；
C2——第二稀釋度（高稀釋倍數）用於鑒定試驗的菌落數；
1.1——計算係數；
d ——稀釋因子（第一稀釋度）。
10 結果與報告
根據Baird-Parker平板或RPF平板上金黃色葡萄球菌的典型菌落數，按9中公式計算，報告每g（mL）樣品中金黃色葡萄球菌數，以CFU/g(mL)表示；如T值為0，則以小於1乘以最低稀釋倍數報告。
第三法 金黃色葡萄球菌MPN計數
11檢驗程序
金黃色葡萄球菌MPN計數程序見圖3。
12 操作步驟
12.1樣品的稀釋
按8.1進行。
12.2 接種和培養
12.2.1 根據對樣品汙染狀況的估計，選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液接種到7.5 %氯化鈉肉湯管，每個稀釋度接種3管，將上述接種物36 ℃±1 ℃培養，18 h～24 h。
12.2.2 用接種環從有細菌生長的各管中，移取1環，分別接種Baird-Parker平板或RPF平板，36 ℃±1 ℃培養，24 h～48 h。
12.3 典型菌落確認
見8.3
13 結果與報告
根據證實為金黃色葡萄球菌陽性的試管管數，查MPN檢索表（見附錄C），報告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌的最可能數，以MPN/g（mL）表示。
