GBT 4789.41-2016 腸杆菌科檢驗

１　範圍
本標準規定了食品中腸杆菌科（Enterobacteriaceae）的檢驗方法。
本標準第一法適用於腸杆菌科含量較高的食品中腸杆菌科的計數；第二法適用於腸杆菌科含量較低食品中腸杆菌科的計數。
２ 術語和定義
２.１
腸杆菌科　
在給定條件下發酵葡萄糖產酸、氧化酶陰性的需氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞杆菌。
２.２
腸杆菌科計數　
按本標準規定方法，對每克或每毫升檢樣中的腸杆菌科進行計數。
２.３
最可能數　
基於泊鬆分布的一種間接計數方法。
３ 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
３．１　恒溫培養箱：３６ ℃±１ ℃。
３．２　冰箱：２ ℃～５ ℃。
３．３　水浴箱：４６ ℃±１ ℃。
３．４　天平：感量０．１ｇ。
３．５　顯微鏡：１０倍～１００倍。
３．６　均質器。
３．７　振蕩器。
３．８　無菌吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ 刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ 刻度）或微量移液器及吸頭。
３．９　無菌錐形瓶或等效容器：容量１５０ｍＬ、５００ｍＬ。
３．１０　無菌培養皿：直徑９０ｍｍ。
３．１１　無菌試管：１８ｍｍ×１８０ｍｍ、１５ｍｍ×１５０ｍｍ。
３．１２　ｐＨ 計或ｐＨ 比色管或精密ｐＨ 試紙。
４　培養基和試劑
４．１　緩衝蛋白腖水（ＢＰＷ）：見Ｂ．１。
４．２　緩衝葡萄糖煌綠膽鹽肉湯（ＥＥ 肉湯）：見Ｂ．２。
４．３　結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（ＶＲＢＧＡ）：見Ｂ．３。
４．４　營養瓊脂（ＮＡ）：見Ｂ．４。
４．５　葡萄糖瓊脂：見Ｂ．５。
４．６　革蘭氏染色液：見Ｂ．６。
４．７　氧化酶試劑：見Ｂ．７。
４．８　無菌１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ：見Ｂ．８。
４．９　無菌１ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ：見Ｂ．９。
第一法　腸杆菌科平板計數法
５　檢驗程序
腸杆菌科平板計數法檢驗程序見圖１。

６　操作步驟
６．１　樣品的稀釋
６．１．１　固體和半固體樣品：稱取２５ｇ 樣品放入盛有２２５ ｍＬＢＰＷ 的無菌均質杯中，８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均質１ ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或放入盛有２２５ ｍＬ ＢＰＷ 的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，製成１∶１０的樣品勻液。
６．１．２　液體樣品：以無菌吸管吸取２５ｍＬ 樣品放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ 的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，製成１∶１０的樣品勻液。
６．１．３　用１ｍＬ 無菌吸管或微量移液器吸取１∶１０樣品勻液１ｍＬ，沿管壁緩緩注入盛有９ｍＬＢＰＷ 的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不應觸及稀釋液麵），振搖試管或換用１支１ ｍＬ 無菌吸管反複吹打，使其混合均勻，製成１∶１００的樣品勻液。
６．１．４　按６．１．３操作程序，依次製成１０倍遞增係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋１次，換用１支１ｍＬ 無菌吸管或吸頭。從製備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過１５ｍｉｎ。
６．２　傾注平板和培養
６．２．１　根據對樣品汙染狀況的估計及相關限量要求，選擇２個～３個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種２個無菌平皿。同時，分別吸取１ｍＬＢＰＷ 加入兩個無菌平皿內作為空白對照。
６．２．２　將１０ｍＬ～１５ｍＬ 冷卻至４６ ℃的ＶＲＢＧＡ（可放置於４６ ℃±１ ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿，使樣品勻液與培養基充分混勻。
６．２．３　待瓊脂凝固後，傾注一薄層同樣的培養基覆蓋平板表層。防止蔓延生長並使菌落特征更為
明顯。
６．２．４　待ＶＲＢＧＡ 平板上層瓊脂凝固後翻轉平板，３６ ℃±１ ℃培養１８ｈ～２４ｈ。
６．３　典型菌落計數和確認
６．３．１　腸杆菌科典型菌落為有或無沉澱環的粉紅色至紅色或紫色菌落。選取典型菌落數在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ 之間、無蔓延菌落生長的平板，隻計數典型菌落數。菌落計數以菌落形成單位（ＣＦＵ）表示。
６．３．２　其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋
度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板後乘以２，代表一個平板菌落數。
６．３．３　當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。
６．３．４　從每個平板上至少挑取５個（小於５個全選）典型菌落進行確認；如果有不同形態的典型菌落，則每種形態分別至少挑取１個菌落進行確認。
６．３．５　典型菌落的確認：
ａ）　分別將所挑選的每一個菌落，劃線於營養瓊脂平板，３６ ℃±１ ℃培養１８ｈ～２４ｈ，挑取平板上的菌落進行革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗及葡萄糖發酵試驗。
ｂ）　革蘭氏染色鏡檢：腸杆菌科為革蘭氏陰性杆菌，無芽孢，大小為（０．３～１．０）μｍ× （１．０～６．０）μｍ。
ｃ）　氧化酶試驗：用鉑／銥接種環或玻璃棒（不要用鎳鉻接種環）挑取單個菌落塗於浸濕氧化酶試劑的濾紙上，濾紙的顏色在１０ｓ內變成藍紫色，判為陽性反應。
ｄ）　葡萄糖發酵試驗：用接種針挑取少許氧化酶陰性的同一個菌落，穿刺於葡萄糖瓊脂內，於３６ ℃±
１ ℃培養２４ｈ±２ｈ，若試管內的內容物變為黃色，判為陽性反應。
６．４　結果的計算
６．４．１　一般原則
若有兩個連續稀釋度的平板典型菌落數在適宜計數範圍內，按式（１）計算，示例見Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．４。

　式中：
N———樣品中腸杆菌科菌落數；
Σa———確證的腸杆菌科菌落數之和；
n1 ———第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個數（含確證的腸杆菌科菌落）；
n2 ———第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個數（含確證的腸杆菌科菌落）；
d———稀釋因子（第一稀釋度）。
其中，a按式（２）計算：

　式中：
a———確證的腸杆菌科菌落數；
b———某一平板中犃個菌落中被確證為腸杆菌科的菌落數，b≤A；
A———某一平板中用於確認試驗的菌落數；
C———某一平板中典型菌落總數。
６．４．２　低菌落數
若最低稀釋度（包括液體樣品原液）平板的典型菌落數均小於１５ＣＦＵ，具有確證的腸杆菌科菌落，
則以確證的菌落數乘以最低稀釋倍數計算。
若最低稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，或典型菌落數均小於１５ＣＦＵ，且無確證的
腸杆菌科菌落，則以小於１乘以最低稀釋倍數計算。
６．４．３　特殊情況
第一稀釋度平板上的典型菌落數均大於１５０ＣＦＵ，且有確證的腸杆菌科菌落，以及第二稀釋度平板上無確證的腸杆菌科菌落或典型菌落數不在１５ＣＦＵ～１５０ＣＦＵ 之間，則以確證的菌落數乘以第一稀釋倍數計算，示例見Ａ．５。
若所有稀釋度的平板上典型菌落數均不在適宜計數範圍內，且無確證的腸杆菌科菌落，則以小於１乘以最低稀釋倍數計算。
７　報告
７．１　菌落數小於１００時，以整數報告。
７．２　菌落數大於或等於１００時，對第３位數字進行修約後，取前２位數字，後麵用０代替位數；也可用１０的指數形式來表示，采用兩位有效數字。
７．３　數字修約按“四舍五入”原則進行。
７．４　若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。
７．５　若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。
７．６　稱重取樣以ＣＦＵ／ｇ為單位報告，體積取樣以ＣＦＵ／ｍＬ 為單位報告。
第二法　腸杆菌科犕犘犖計數法
８　檢驗程序
腸杆菌科ＭＰＮ 計數法檢驗程序見圖２。

９　操作步驟
９．１　樣品的稀釋
按６．１進行。
９．２　接種和培養
９．２．１　非選擇性前增菌
根據對樣品汙染狀況的估計及相關限量要求，選擇３ 個適宜連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度３管，共９管ＢＰＷ 於３６ ℃ ±１ ℃培養１８ｈ±２ｈ。
９．２．２　選擇性增菌
從ＢＰＷ 各培養管中，分別移取１ｍＬ 培養物，接種於１０ｍＬ 的ＥＥ 肉湯中，３６℃±１℃培養２４ｈ±２ｈ。
９．２．３　分離
用接種環從ＥＥ 各肉湯管中分別取培養物１環，劃線接種於ＶＲＢＧＡ 平板，３６ ℃±１ ℃培養２４ｈ±２ｈ，觀察平板上有無典型菌落。
９．３　典型菌落的確認
典型菌落確認見６．３。
１０　報告
腸杆菌科為革蘭氏陰性無芽胞杆菌，發酵葡萄糖產酸、氧化酶陰性。隻要有１個菌落確認為腸杆菌科，其所代表的ＥＥ 管即為腸杆菌科陽性，依據ＥＥ 陽性管數查ＭＰＮ 表（見附錄Ｃ），報告每克（毫升）樣品中腸杆菌科的ＭＰＮ 值。稱重取樣以ＭＰＮ／ｇ為單位報告，體積取樣以ＭＰＮ／ｍＬ 為單位報告。

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