1 範圍
本標準規定了出口食品中產氣莢膜梭狀芽孢杆菌的計數檢驗方法。
本標準適用於出口食品中產氣莢膜梭狀芽孢杆菌的檢驗。
2 規範性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法
SN/T 1538.1 培養基製備指南 第1部分：實驗室培養基製備質量保證通則
SN/T 1538.2 培養基製備指南 第2部分：培養基性能測試實用指南3 術語和定義下列術語和定義適用於本文件
3 術語及定義
下列術語和定義適用於本文件。
3.1
產氣莢膜梭狀芽孢杆菌
在特定的選擇性培養基上，細菌菌落生長呈現黑色特點（亞硫酸鹽降解為硫化物而形成黑色沉澱物，並使菌落呈現黑色），分解乳糖產酸產氣，48ｈ內能液化明膠的細菌。
4 設備和材料
4.1 無菌吸管：1.0ｍＬ 和10.0ｍＬ，分刻度分別為0.1ｍＬ 和1.0ｍＬ。
4.2 無菌培養皿：直徑90ｍｍ。
4.3 均質器及均質袋（或均質杯）。
4.4 恒溫培養箱或厭氧培養箱：37℃±0.5 ℃。
4.5 恒溫水浴鍋：46 ℃±0.5 ℃。
4.6 厭氧發生裝置。
4.7 放大鏡和（或）菌落計數器。
4.8 光學顯微鏡10×～100×。
4.9 冰箱：2 ℃～8 ℃。
4.10 天平：感量0.1ｇ。
4.11 全自動微生物鑒定係統。
５ 培養基和試劑
除另有規定外，所用試劑均為分析純，水為GB／T 6682規定的分析實驗室用水。
5.1 亞硫酸鹽環絲氨酸瓊脂（SC）：見Ａ．１。
5.2 液體硫乙醇酸鹽培養基：見Ａ．２。
5.3 乳糖亞硫酸鹽培養基（LS）：見Ａ．３。
5.4 緩衝動力硝酸鹽培養基：見Ａ．４。
5.5 亞硝酸鹽檢測試劑：見Ａ．５。
5.6 鋅粉。
5.7 乳糖明膠培養基：見Ａ．６。
5.8 蛋白腖水：見Ａ．７。
5.9 ＶＩＴＥＫ２ＡＮＩ生化鑒定卡。
6 檢驗程序
產氣莢膜梭狀芽孢杆菌檢驗程序見圖
7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
7.1.1 無菌操作稱取檢樣25ｇ（ｍＬ）放入無菌均質器或均質袋中，加入225 ｍＬ 蛋白腖水，均質，製成1∶10樣品勻液。
7.1.2 吸取1∶10樣品勻液1ｍＬ，加入到9ｍＬ 蛋白腖水中，混合均勻，製成1:100樣品勻液。必要時，按此法將樣品作進一步的10倍遞增稀釋。
7.2 接種與培養
7.2.1 選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），每個稀釋度分別吸取1ｍＬ 樣品勻液加入到兩個無菌平皿內。
7.2.2 將10ｍＬ～15ｍＬ 維持在44 ℃～47 ℃的SC瓊脂傾注平皿，轉動平皿使其混合均勻。待培養基凝固後，再覆蓋上10ｍＬSC瓊脂，待其完全凝固。
7.2.3 翻轉平板，放入厭氧罐或其他適宜容器中，厭氧環境下37℃±0.5 ℃下培養20ｈ±2ｈ。培養時間過長可能會導致平板顏色過黑。
7.3 平板計數
7.3.1 選取菌落數＜150ＣＦＵ 的平板，計數每個平板上的黑色菌落數，記錄稀釋倍數。
7.3.2 每個平板挑取５個典型或可疑菌落（小於５個時應全部挑選）進行確證。
7.4 乳糖亞硫酸鹽試驗確證
7.4.1 接種
將SC 瓊脂上的典型或可疑菌落接種到液體硫乙醇酸鹽培養基中，厭氧環境下37℃±0.5 ℃下培養18ｈ～24ｈ。以無菌吸管移取硫乙醇酸鹽培養物5滴加入到乳糖亞硫酸鹽（LS）培養基中。46 ℃水浴中需氧條件下培養18ｈ～24ｈ。
7.4.2 觀察
觀察倒管內有否氣泡產生及試管底部是否變黑（亞硫酸鐵沉澱），若倒管中四分之一以上充滿氣體並且有黑色沉澱物則可判定為陽性。當倒管中產生的氣體不足四分之一時，立即以無菌吸管從先前的ＬＳ培養基中吸取5滴加到另一LS培養基試管中，46℃水浴培養18ｈ～24ｈ，再次觀察結果。
7.4.3 判讀
在SC 培養基中形成黑色菌落，同時LS培養基中反應陽性的細菌，可確認為產氣莢膜梭狀芽孢杆菌，除此之外應視為陰性。
7.5 動力硝酸鹽試驗和乳糖明膠液化試驗確證
7.5.1 純化
7.5.2 接種
將挑取的純菌落分別穿刺接種緩衝動力硝酸鹽培養基和乳糖明膠培養基，厭氧條件下37℃ ±0.5 ℃培養24ｈ。
7.5.3 動力硝酸鹽試驗觀察
在透射光下檢查緩衝動力硝酸鹽培養基試管中細菌沿穿刺線生長情況，有動力的菌株沿著穿刺線呈擴散生長；沒有動力的菌株，僅沿穿刺線生長。分別加0.5ｍＬ 試劑甲與0.2ｍＬ 試劑乙於緩衝動力硝酸鹽培養基中以檢查亞硝酸鹽的存在。出現橙紅色者，表明有菌株將硝酸鹽還原成了亞硝酸鹽。若15ｍｉｎ內未出現顏色變化，則添加少許金屬鋅粉，放置10ｍｉｎ。如果加鋅粉後出現橙紅色，表明菌株不能還原硝酸鹽。若出現微弱的亞硝酸鹽反應（如：淺粉色）則應排除，因為產氣莢膜梭狀芽孢杆菌的反應比較劇烈而且迅猛。
7.5.4 乳糖明膠試驗觀察
發現產氣和培養基變黃色，表明乳糖發酵並產酸。將試管置5℃冷卻1ｈ，檢查明膠液化情況。若培養基仍為固態，則需37 ℃±0.5 ℃再培養24ｈ，再次檢查明膠是否液化。
7.5.5 判讀
在SC 瓊脂上形成黑色菌落，無動力的，通常會將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，分解乳糖產酸產氣，48ｈ內能液化明膠的細菌，確認為產氣莢膜梭狀芽孢杆菌。
7.6 自動微生物鑒定係統確證
將SC 瓊脂上的典型或可疑菌落接種到液體硫乙醇酸鹽培養基中，厭氧條件下37℃±0.5 ℃培養18ｈ～24ｈ，劃線接種SC瓊脂平板，再覆蓋上10ｍLSC瓊脂。待其完全凝固後，厭氧條件下37℃±0.5℃培養18ｈ～24ｈ，獲得純培養菌落。如有必要，可重複上述步驟，以獲得完全分離的，典型的黑色菌落。
如選擇VITEK compact，可從SC平板上挑選可疑菌落，用生理鹽水製成濁度適當的菌懸液，使用VITEK compact全自動微生物鑒定係統進行鑒定。
7.7 判定
任何符合7.4.3或者7.5.5的判讀確證或者經7.6的鑒定為產氣莢膜梭狀芽孢杆菌的菌落，確認為產氣莢膜梭狀芽孢杆菌。
8 結果報告
樣品中產氣莢膜梭狀芽孢杆菌的計數，基於被證實為產氣莢膜梭狀芽孢杆菌菌落的百分數。
例如：10-4稀釋的平板中，平均有85個菌落，由2個平板上選取的10個菌落中，有8個被證實為產氣莢膜梭菌，那麽每克食品中產氣莢膜梭狀芽孢杆菌數，即為85×（8／10）×10000＝680000CFU。
根據計算結果報告檢樣中產氣莢膜梭狀芽孢杆菌數／g（ml）。
