前 言
本標準代替GB4789.3—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》、GB/T4789.32—2002《食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群的快速檢測》和SN/T0169—2010《進出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸杆菌檢測方法》大腸菌群計數部分。
本標準與GB4789.3—2010相比,主要變化如下:
———增加了檢驗原理;
———修改了適用範圍;
———修改了典型菌落的形態描述;
———修改了第二法平板菌落數的選擇;
———修改了第二法證實試驗;
———修改了第二法平板計數的報告。
1 範圍
本標準規定了食品中大腸菌群(Coliforms)計數的方法。
本標準第一法適用於大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數;第二法適用於大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計數。
2 術語和定義
2.1
大腸菌群 Coliforms
在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞杆菌。
2.2
最可能數 Mostprobablenumber;MPN
基於泊鬆分布的一種間接計數方法。
3 檢驗原理
3.1 MPN 法
MPN法是統計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經係列稀釋並培養後,根據其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應用統計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。
3.2 平板計數法
大腸菌群在固體培養基中發酵乳糖產酸,在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色,帶有或不帶有沉澱環的菌落。
4 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外,其他設備和材料如下:
4.1 恒溫培養箱:36℃ ±1℃。
4.2 冰箱:2℃~5℃。
4.3 恒溫水浴箱:46℃±1℃。
4.4 天平:感量0.1g。
4.5 均質器。
4.6 振蕩器。
4.7 無菌吸管:1mL(具0.01mL 刻度)、10mL(具0.1mL 刻度)或微量移液器及吸頭。
4.8 無菌錐形瓶:容量500mL。
4.9 無菌培養皿:直徑90mm。
GB4789.3—2016
4.10 pH 計或pH 比色管或精密pH 試紙。
4.11 菌落計數器。
5 培養基和試劑
5.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖(laurylsulfatetryptose,LST)肉湯:見A.1。
5.2 煌綠乳糖膽鹽(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉湯:見A.2。
5.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violetredbileagar,VRBA):見A.3。
5.4 無菌磷酸鹽緩衝液:見A.4。
5.5 無菌生理鹽水:見A.5。
5.6 1mol/LNaOH 溶液:見A.6。
5.7 1mol/LHCl溶液:見A.7。
第一法 大腸菌群MPN 計數法
6 檢驗程序
大腸菌群MPN 計數的檢驗程序見圖1。
圖1 大腸菌群MPN 計數法檢驗程序
7 操作步驟
7.1 樣品的稀釋
7.1.1 固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內8000r/min~10000r/min均質1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質袋中,用拍擊式均質器拍打1min~2min,製成1∶10的樣品勻液。
7.1.2 液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置於機械振蕩器中振搖,充分混勻,製成1∶10的樣品勻液。
7.1.3 樣品勻液的pH 應在6.5~7.5之間,必要時分別用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl調節。
7.1.4 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反複吹打,使其混合均勻,製成1∶100的樣品勻液。
7.1.5 根據對樣品汙染狀況的估計,按上述操作,依次製成十倍遞增係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從製備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。
7.2 初發酵試驗
每個樣品,選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯),36℃±1℃ 培養24h±2h,觀察倒管內是否有氣泡產生,24h±2h產氣者進行複發酵試驗(證實試驗),如未產氣則繼續培養至48h±2h,產氣者進行複發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。
7.3 複發酵試驗(證實試驗)
用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1 環,移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中,36℃±1℃培養48h±2h,觀察產氣情況。產氣者,計為大腸菌群陽性管。
7.4 大腸菌群最可能數(MPN)的報告
按7.3確證的大腸菌群BGLB陽性管數,檢索MPN 表(見附錄B),報告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN 值。
第二法 大腸菌群平板計數法
8 檢驗程序
大腸菌群平板計數法的檢驗程序見圖2。
圖2 大腸菌群平板計數法檢驗程序
9 操作步驟
9.1 樣品的稀釋
按7.1進行。
9.2 平板計數
9.2.1 選取2個~3個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
9.2.2 及時將15mL~20mL融化並恒溫至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿,將培養基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固後,再加3mL~4mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉平板,置於36℃±1℃培養18h~24h。
9.3 平板菌落數的選擇
選取菌落數在15CFU~150CFU 之間的平板,分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落(如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環,菌落直徑為0.5mm或更大,最低稀釋度平板低於15CFU 的記錄具體菌落數。
9.4 證實試驗
從VRBA 平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,少於10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種於BGLB肉湯管內,36℃±1℃培養24h~48h,觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣,即可報告為大腸菌群陽性。
9.5 大腸菌群平板計數的報告
經最後證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以9.3中計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA 平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小於1乘以最低稀釋倍數計算。
附 錄 A
培養基和試劑
A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖(LST)肉湯
A.1.1 成分
胰蛋白腖或胰酪腖20.0g
氯化鈉5.0g
乳糖5.0g
磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2.75g
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 2.75g
月桂基硫酸鈉0.1g
蒸餾水1000mL
A.1.2 製法
將上述成分溶解於蒸餾水中,調節pH 至6.8±0.2。分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管10mL。
121℃高壓滅菌15min。
A.2 煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯
A.2.1 成分
蛋白腖10.0g
乳糖10.0g
牛膽粉(oxgall或oxbile)溶液200mL
0.1%煌綠水溶液13.3mL
蒸餾水800mL
A.2.2 製法
將蛋白腖、乳糖溶於約500mL 蒸餾水中,加入牛膽粉溶液200mL(將20.0g脫水牛膽粉溶於200mL 蒸餾水中,調節pH 至7.0~7.5),用蒸餾水稀釋到975mL,調節pH 至7.2±0.1,再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL,用蒸餾水補足到1000mL,用棉花過濾後,分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管10mL。121℃高壓滅菌15min。
A.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)
A.3.1 成分
蛋白腖7.0g
酵母膏3.0g
乳糖10.0g
氯化鈉5.0g
膽鹽或3號膽鹽1.5g
中性紅0.03g
結晶紫0.002g
瓊脂15g~18g
蒸餾水1000mL
A.3.2 製法
將上述成分溶於蒸餾水中,靜置幾分鍾,充分攪拌,調節pH 至7.4±0.1。煮沸2min,將培養基融化並恒溫至45℃~50℃傾注平板。使用前臨時製備,不得超過3h。
A.4 磷酸鹽緩衝液
A.4.1 成分
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 34.0g
蒸餾水500mL
A.4.2 製法
貯存液:稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶於500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH 至7.2±0.2,用蒸餾水稀釋至1000mL後貯存於冰箱。稀釋液:取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝於適宜容器中,121℃高壓滅菌15min。
A.5 無菌生理鹽水
A.5.1 成分
氯化鈉8.5g
蒸餾水1000mL
A.5.2 製法
稱取8.5g氯化鈉溶於1000mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min。
A.6 1mol/LNaOH 溶液
A.6.1 成分
NaOH 40.0g
蒸餾水1000mL
A.6.2 製法
稱取40g氫氧化鈉溶於1000mL無菌蒸餾水中。
A.7 1mol/LHCl溶液
A.7.1 成分
HCl 90mL
蒸餾水1000mL
A.7.2 製法
移取濃鹽酸90mL,用無菌蒸餾水稀釋至1000mL。
附 錄 B
大腸菌群最可能數(MPN)檢索表
B.1 大腸菌群最可能數(MPN)檢索表
每g(mL)檢樣中大腸菌群最可能數(MPN)的檢索見表B.1。
表B.1 大腸菌群最可能數(MPN)檢索表
