一、試驗原理：
細菌在葡萄糖代謝中生成丙酮酸，從丙酮酸開始，隨細菌種類不同而有多種分解途徑，有的使丙酮酸進一步分解，生成甲酸、乙酸、乳酸等終產物，有的可以使丙酮酸脫羧變為中性最終產物乙酰甲基甲醇（Acetylmethyl carbinol），亦稱3-羧基丁酮（Acetoin）。本試驗即為檢查某些細菌在葡萄糖代謝中是否產生乙酰甲基甲醇，作為鑒定依據。
乙酰甲基甲醇在堿性環境中可被空氣中的氧氣氧化為丁二酮（Diacetyl），丁二酮與蛋白腖中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，即為V-P試驗陽性。
肌酸或肌酸酐可供給比精氨酸更多的胍基，故有加快V-P試驗出現陽性反應的作用。
不加α-萘酚，至少要有10PPm的丁二酮才能出現陽性，加入α-萘酚可使V-P試驗的靈敏度提高約50倍而不降低試驗的特異性，其酒精液還有增強顏色的作用。在試驗中，必須先加入α-萘酚，使其先與丁二酮和胍基複合物結合，然後才能加入40%氫氧化鉀溶液，加入量不得超過0.2ml。若加入次序顛倒，氫氧化鉀可與蛋白腖某些成分反應產生橙紅色而造成假陽性。氫氧化鉀作為氧化劑可加速乙酰甲基甲醇氧化為丁二酮，並有助於二氧化碳的吸收。
二、試驗結果判斷：
三、注意事項：
牛肉浸湯不能用於本試驗，因在肌肉浸出物中含有乙酰甲基甲醇、丁二酮以及其它幹擾試驗的物質，可造成假陽性。
V-P試驗陽性菌偶爾也會不出現陽性反應，為避免這種情況，可將加有試劑的培養物於50℃左右輕微加熱，陽性菌即出現紅色，而真正陰性菌仍保持原色。
在通用培養基中，一般培養1-3天多數能出現陽性反應，培養時間過長，可因產酸而使V-P反應減弱或造成假陰性。
一般來說，V-P試驗和甲基紅試驗多呈相反結果。但應注意，這也不是絕對的，有少數細菌如蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）和奇異變形杆菌有時兩試驗均出現陽性反應。
本試驗一般用於腸杆菌科各菌屬的鑒別。在用於芽孢杆菌和葡萄球菌等其它細菌時，通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基甲醇的產生，故應省去或以氯化鈉代替。
關於V-P試驗培養物的培養溫度，一般多采用35℃或37℃，但日本有學者認為37℃培養常使分解乙酰甲基甲醇的酶失去活性，故主張采用28-30℃培養，夏季可培養於室溫。已知有少數細菌，如哈夫尼亞腸杆菌，在37℃培養的V-P試驗結果常不穩定，需在25-30℃培養，才能獲得可靠結果。
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