仔豬腹瀉是困擾規模化養豬生產的主要難題之一，致病性大腸杆菌是造成新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的最重要的病原，其中產腸毒素大腸杆菌（enterotoxigenic escherichia coil，etec）是最主要的致病菌（morris等，1985；楊正時，1987；yokayama等，1992；alexander,1994；hampson，1994）。bergland（1980）報道，從斷乳前腹瀉仔豬中分離到etec的機率為45.6%，其頻度比豬球蟲(23%)和輪狀病毒(20.9%)感染的總和還多。alexander（1994）發現，由etec引起仔豬斷奶前腹瀉而造成的死亡率占仔豬死亡率的11％。同年，hampson等另一項調查認為etec造成的仔豬斷奶後腹瀉平均每年就造成1.5%～2%的斷奶仔豬死亡。王紅寧等（1999）在1995～1999年間對四川等地規模化豬場的流行病學調查發現，由etec引起的仔豬黃、白痢的發生率達20％～60％，混合感染死亡率可達60％以上。
抗生素作為控製細菌感染的有效藥物廣泛應用於生產中，但抗生素的長期使用引起的耐藥性問題和生產中超量使用抗生素的現象越來越突出，但控製效果卻並不樂觀。抗生素替代品的研究成為畜牧業發展的迫切需求。
初生仔豬和早期斷奶仔豬自身免疫功能的不成熟以及早期斷奶應激引起的免疫抑製，是造成仔豬對etec敏感性增高、抗病力下降，並引發etec感染性腹瀉的主要因素。利用外源抗體為仔豬提供被動免疫從而預防和治療腸道etec感染引起的疾病的研究將近已有一個世紀的曆史，並證明了外源性抗體的有效作用。其中，雞卵黃抗體因其化學性質穩定、特異性抗體含量高、安全性好、易規模化生產等特點，而越來越受到人們的注意，並有潛力開發為一類可替代抗生素的高效生物防治製劑。近年來國內外的研究結果也證明，應用卵黃抗體防治由etec引起的仔豬腹瀉，能夠取得比較滿意的效果。
根據抗原的製備方式，預防仔豬大腸杆菌性腹瀉卵黃抗體的生產方式可以分為兩類：一類是直接用etec的菌體蛋白作為免疫原，而另一類則是將經分離純化後的菌毛蛋白作為免疫原。有研究證明，後者免疫獲得的卵黃抗體的應用效果優於前者（kim等，1996；肖馳等，1998；marquardt等，1999）。然而，由分離純化後的菌毛抗原製備的卵黃抗體，其成本較高。通過基因工程技術，構建高量表達菌毛蛋白的大腸杆菌，為解決這一問題提供了有效的手段。本文擬對預防仔豬大腸杆菌性腹瀉卵黃抗體的研究進展進行綜述。
1 卵黃抗體的特性及作用機理
自klemperer於1893年首次報道雞蛋中存在抗體以來，人們對蛋中抗體的研究不斷深入。蛋內的抗體主要存在於蛋黃內，以igg占優勢，iga和igm的含量極低（roth，1981；locken，1983）。利用經過特異性免疫的母雞來生產卵黃抗體，比從哺乳動物血液中獲得的抗體具有突出的優越性：①易於生產。實際生產中，動物采血不僅對動物本身是極大的應激，且費時費工。雞產蛋無傷害性和對佐劑不起像哺乳動物中出現的嚴重反應，因而方便得多；②產量高，成本低 。以一隻母雞為例，其年產蛋量為200～300枚，每隻蛋中約含抗體100～150mg（larsson，1993）；③卵黃抗體穩定性好，耐酸、耐堿、耐熱（losch等，1986；shimizu等，1992；李學伍，2000），有利於運輸、貯藏。
預防仔豬大腸杆菌性腹瀉卵黃抗體對宿主特異性菌毛抗原有強烈的親和力（yutaka，1995），能夠阻斷或降低宿主特異性菌毛與仔豬小腸上皮的結合，使etec不能在小腸定居繁殖，從而阻斷了大腸杆菌產生腸毒素，防止和減少仔豬腹瀉的發生（jin等，1998）。
2 預防仔豬大腸杆菌性腹瀉卵黃抗體對仔豬腹瀉的效果
盡管預防仔豬大腸杆菌性腹瀉卵黃抗體的生產方式不同，其機理都是通過特異性的卵黃抗體來阻斷或降低大腸杆菌的宿主特異性菌毛與仔豬小腸上皮的結合（jin等，1998），使etec不能在小腸定居繁殖和產生腸毒素，從而防止腹瀉的發生。飼料中添加少量的卵黃抗體，可以顯著地降低仔豬腹瀉率，並在一定程度上提高動物的增重、飼料轉化率。
一些研究者直接用大腸杆菌菌株免疫產蛋母雞來獲得卵黃抗體（胡子信，1994；李國平，2002）。李國平等（2002）用etec k88、k99、987p、f41標準菌株製成的滅活油佐劑作為免疫原，待產蛋雞免疫後收集高免卵黃，然後提取、純化，精製成雞抗豬大腸杆菌特異性高免卵黃抗體並用於臨床。結果表明該製劑安全性好，每頭仔豬注射或口服2～4ml劑量，能有效預防仔豬大腸杆菌性腹瀉。而徐福洲等（2002）同樣利用etec標準菌株製備滅活苗,免疫待開產母雞，提純卵黃抗體對攻毒仔豬口服治療，結果顯示治療仔豬腹瀉狀況明顯減輕，與對照組相比有顯著差異；治療組未出現死亡而對照組仔豬有33%～67%的死亡率。此結果表明，卵黃抗體治療由etec所致的仔豬腹瀉具有明顯的效果。
另外一些研究者則采用分離出純化後的大腸杆菌菌毛蛋白作為免疫原，通過多次免疫健康的產蛋母雞，從而獲得卵黃抗體。yokoyama（1992）將提純的etec宿主特異性菌k88、k99、987p製成菌毛蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫產蛋母雞，抗體達到高效價後，收集雞蛋從蛋黃中分離和噴霧幹燥抗體，對不同etec菌株感染的初生未食初乳仔豬用適當的抗體治療。試驗中，所有仔豬接受不同菌株感染後12h內均發生中度或嚴重腹瀉，用效價為1：625和1：2 500的抗體治療仔豬全部存活，而對照組超過80%的仔豬死亡。同時，他們還研究了從雞蛋卵黃中提取幹粉抗體的方法。所提純的卵黃抗體可以用於治療仔豬大腸杆菌腹瀉；使用前的保存和運輸過程不需低溫，使用方便而且效果比較可靠。yutaka（1992）在飼糧中添加經etec k99菌毛蛋白免疫得到的卵黃抗體，當效價為1：800和1：1 600時，能夠有效治愈所有腹瀉仔豬，並提高了仔豬的日增重。
本實驗室用分離提純的特異性菌毛抗原製備抗etec 的卵黃抗體，應用細菌體外粘附試驗研究了卵黃抗體預防仔豬etec感染性腹瀉的機製，並通過飼養試驗研究了卵黃抗體預防斷奶仔豬腹瀉的效果。結果表明：在體外試驗中，無抗體的對照組平均每個上皮細胞黏附16.4個k88ac；抗體效價分別為1：640和1：1 280的卵黃抗體較對照組均極顯著抑製了k88ac對腸上皮細胞的黏附作用（p<0.01），平均每個上皮細胞分別僅黏附8.5和2.4個細菌，二者之間也存在極顯著差異（p<0.01）；抗體效價為1：320的抗體組相對對照組有一定抑製細菌粘附作用，但差異不顯著（p＝0.15）。用90頭28日齡斷奶仔豬進行了為期4周的飼養試驗。試驗以玉米—豆粕典型日糧為對照組，在對照組日糧中分別添加0.5％、1％、2％的噴霧幹燥卵黃粉形成試驗一組、試驗二組和三組的試驗日糧。添加1％卵黃抗體粉顯著降低了料肉比和腹瀉率（p<0.05），促進了試驗期仔豬的平均日增重（p=0.052）。
kim等(1996)曾分別以etec的k88菌毛和減毒菌株作為抗原製備卵黃抗體，並對其效價進行了比較，結果表明前者免疫得到的卵黃抗體效價明顯高於後者。為比較由菌毛免疫和菌株免疫兩種不同方法所得卵黃抗體的臨床效果，肖馳等（1998）用這兩種方法製備的卵黃抗體進行了臨床預防和治療試驗；結果表明，兩種卵黃抗體均能有效地預防和治療仔豬大腸杆菌性腹瀉；但菌毛蛋白疫苗卵黃抗體的應用效果更好。
此外，部分研究者用多價菌苗免疫獲得卵黃抗體，用於防治仔豬腹瀉也取得較好的效果，同時增加了卵黃抗體作用的廣譜性。胡子信等（1994）將引起仔豬嚴重發病的腸產毒素性大腸杆菌k88、k99、987p三個標準菌株，製成大腸杆菌三價菌苗，免疫接種健康產蛋雞，製成雞抗豬大腸杆菌高免卵黃液，並用以對仔豬大腸杆菌病進行預防和治療，其有效率達到100%。李學伍（2000）等用分離純化後的多價菌株的菌毛蛋白作為抗原，製備了抗仔豬大腸杆菌性腹瀉的多價卵黃抗體。經試驗證明，該多價卵黃抗體粉對發病仔豬的治愈率最高可達97.7%，比藥物治療的治愈率高21.2%。然而，華榮虹等（2002）比較k88、k99、987p、f41單一菌毛免疫與4種菌毛混合免疫母雞的效果發現，菌毛單獨免疫後卵黃抗體效價均高於混合菌毛苗免疫後相應卵黃抗體的效價。
在選擇試驗菌株時，大部分人選用標準菌株，也有一些研究者選用地方株。如marquardt等（1999）采用地方株etec（k88+）菌毛抗原免疫母雞後獲得卵黃抗體，其對新生和斷奶感染etec的仔豬不僅有保護作用，而且在商業性豬場用於提前斷奶的仔豬也有效。他們的試驗結果表明，用k88+ e.coli誘導而腹瀉的3日齡仔豬，在用雞蛋抗體後24h被治愈。而用未免疫母雞蛋黃粉處理的，仔豬繼續腹瀉，其中62.5%因嚴重腹瀉而死亡。在21日齡斷奶仔豬的感染試驗中，飼喂蛋黃抗體後有短暫的腹瀉，試驗期間100%存活且體重明顯增加，而對照組則出現嚴重的腹瀉和脫水症狀，且48h內有仔豬死亡。對豬場14～18日齡的斷奶仔豬的飼喂試驗表明：飼喂含卵黃抗體日糧的仔豬在腹瀉發生率和嚴重程度上均比飼喂含抗菌素的商品日糧組低。高雲英等（2003）應用仔豬大腸杆菌標準菌株和地方分離菌株混合免疫商品蛋雞，收獲高免蛋製備多價卵黃抗體。經預防、攻毒試驗及臨床治療效果觀察,對仔豬免疫保護率可達90%以上，攻毒保護率98%以上，臨床治愈率95%以上。
3 利用基因工程技術製備菌毛抗原的研究
過去的研究中，etec 菌毛蛋白提取純化方法已得到不斷優化，而卵黃抗體的生產加工也已逐步工業化。本實驗室在前期工作中也已經建立了快速準確的etec及其亞型的分子鑒定方法，並研製開發出預防仔豬大腸杆菌性腹瀉卵黃抗體。然而，針對菌毛蛋白表達量少的問題，有必要進一步研究降低抗原生產成本的技術。
基因工程的本質就是按照人們的設計藍圖，將生物體內控製性狀的基因進行優化重組，並使其穩定遺傳和表達。基因工程技術利用細菌（如大腸杆菌和酵母菌等）基因表達調控機製相對簡單和生長速度較快等特點，令其超量合成其它生物體內含量極微但卻具有較高經濟價值的生化物質。目前，已有100多種異源蛋白通過大腸杆菌基因工程均實現了產業化，其中包括一些結構相當複雜的人體蛋白，如富含半胱氨酸殘基的血清白蛋白（has）、尿激酶原（pro-uk）、金屬硫蛋白等（張惠展，2002）。
國內外已有許多研究者在構建etec粘附素抗原的基因工程菌株方麵開展了工作。mooi fr等（1981）構建了含有k88ab抗原基因的重組質粒pfm205，進行轉化，獲得的重組菌株能與特異性抗k88ab的抗體結合。dougan 等（1983）構建了含k88ac粘附素抗原的質粒pmf005，重組質粒依賴pbr322自身編碼的啟動子，能使k88ac粘附素抗原的表達水平升高。此外，這些研究者認為，若 pbr322啟動子被編碼色氨酸的啟動子取而代之，那麽當色氨酸啟動子被阻遏時，重組質粒trp-pmk005表達 k88ac粘附素抗原的水平提高（kehoe m等，1983）。後來，dougan 等（1986）用免疫試驗證明了含重組質粒pmk005的工程菌株具有較好的免疫活性，但對於如何解決k88粘附素抗原的高效表達沒有進一步的研究。holoda e和mikula i（1994）曾報道用ptac 啟動子代替質粒pbr322的p啟動子，使k88ab抗原更易在受體菌中表達；且表達量高於k88ab野生型菌株，其中在受體菌e.coli c600中表達量最高，同時在沙門氏傷寒菌tm333中的表達水平與e.coli c600相當（holoda e和mikula i，1995）。但對於構建後工程菌株粘附素蛋白表達的穩定性並未進行研究。
在國內，洪孟民等（1985）率先研製成etec k88工程菌；而張林元等（1985）用不同的受體菌也構建了不產生腸毒素的k88ac抗原工程菌株。同時，張景六等（1985）構建了帶有k88和k99兩種菌毛抗原基因的質粒，為預防不同菌毛抗原型etec引起的仔豬腹瀉提供了更廣泛的作用。而攜帶此質粒的工程菌株合成k99亞基和菌毛的能力略差於僅表達k99菌毛抗原的菌株。隨後，李豐生等（1987）用基因工程技術構建了含etec k88ac和lt（a-b+）兩種抗原基因的菌株。此菌株的菌毛抗原的表達量與其親本株基本相同。20世紀90年代，吳雅旭等（1991）用強啟動子代替載體自身的啟動子，結果獲得了菌毛抗原表達效率為原株16倍的etec k88ac抗原基因工程株。然而，研究者發現該重組子原代細胞於4℃放置數天，或連續傳幾代後，即使在氨卞青黴素抗性培養基上生長，表達水平也會明顯降低。可見，其質粒不穩定，易丟失。針對這一缺陷的改進，將近十年國內都沒有相關的研究報道。
可以預見，隨著基因工程技術的進一步發展，以及新啟動子的不斷出現和dna重組載體/受體係統的多樣化，可以利用基因工程技術來構建高效、穩定表達etec菌毛蛋白的菌株，提高菌毛抗原的產量，從而大大降低卵黃抗體成本，促進這一替代抗生素新型添加劑的廣泛應用。
上一篇：抽樣檢驗的相關術語
