2月6日，國家衛生健康委發布了新型冠狀病毒感染的肺炎防控方案（第四版），同時作為附件發布了新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第四版）。
為指導各級疾控部門和其他相關機構開展新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測工作，特製定本技術指南。本指南主要介紹目前已經比較成熟、易於實施的核酸檢測方法。
一、標本采集
（一）采集對象。
新型冠狀病毒肺炎疑似病例、臨床診斷病例（僅限湖北省）和聚集性病例，其他需要進行新型冠狀病毒感染診斷或鑒別診斷者，或其他需要進一步篩查檢測的環境或生物材料（如溯源分析）。
（二）標本采集要求。
1.從事新型冠狀病毒檢測標本采集的技術人員應經過生物安全培訓（培訓合格）和具備相應的實驗技能。采樣人員個人防護裝備（personal protective equipment，PPE）要求：N95 及以上防護口罩、護目鏡、連體防護服、雙層乳膠手套、防水靴套；如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應及時 更換外層乳膠手套。
2.住院病例的標本由所在醫院的醫護人員采集。
3.密切接觸者標本由當地指定的疾控機構、醫療機構負責 采集。
4．根據實驗室檢測工作的需要，可結合病程多次采樣。
（三）標本采集種類。
每個病例必須采集急性期呼吸道標本（包括上呼吸道標本 和下呼吸道標本）；重症病例優先采集下呼吸道標本（如支氣管 或肺泡灌洗液等）；出現眼部感染症狀的病例，需采集眼結膜拭子標本；出現腹瀉症狀的病例，需留取便標本。可根據臨床表 現與采樣時間間隔進行采集。
其他研究材料依據設計需求采集。
標本種類：
1.上呼吸道標本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物等。
2.下呼吸道標本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管 灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本。
3.血液標本：盡量釆集發病後7天內的急性期抗凝血。采集量5ml,以空腹血為佳，建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集血液。
4.血清標本：盡量釆集急性期、恢複期雙份血清。第一份 血清應盡早（最好在發病後7天內）釆集，第二份血清應在發病 後第3～4周釆集。采集量5ml,建議使用無抗凝劑的真空釆血管。 血清標本主要用於抗體的測定，從血清抗體水平對病例的感染狀況進行確認。血清標本不進行核酸檢測。
5.眼結膜標本：出現眼部感染症狀的病例需采集眼結膜拭子標本。
6.便標本：出現腹瀉症狀的患者需采集便標本。
（四）標本采集方法。
1.咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料杆拭子同時擦拭雙側咽扁桃體及咽後壁，將拭子頭浸入含3ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩衝液）的管中，尾部棄 去，旋緊管蓋。
2.鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料杆拭子輕輕插入鼻 道內鼻齶處，停留片刻後緩慢轉動退出。取另一根聚丙烯纖維 頭的塑料杆拭子以同樣的方法采集另一側鼻孔。上述兩根拭子 浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。
3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負壓泵相連的收集器 從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部 插入鼻腔或氣管，接通負壓，旋轉收集器頭部並緩慢退出，收集抽取的粘液，並用3ml采樣液衝洗收集器1次（亦可用小兒導 尿管接在50ml注射器上來替代收集器）。
4.深咳痰液：要求病人深咳後，將咳出的痰液收集於含3ml 采樣液的50ml螺口塑料管中。
5.支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負壓，旋轉收集器頭部並緩慢退出。收集抽取的粘液，並用采樣液衝洗收集器1 次（亦可用小兒導尿管接在50ml注射器上來替代收集）。
6.肺泡灌洗液：局部麻醉後將纖維支氣管鏡通過口或鼻經 過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管 分支開口，經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50 ml，總量100～250ml，不應超過300ml。
7.血液標本：建議使用含有EDTA抗凝劑的真空釆血管采集 血液標本5ml，室溫靜置30分鍾，1500～2000rpm離心10分鍾， 分別收集血漿和血液中細胞於無菌螺口塑料管中。
8.血清標本：用真空負壓采血管采集血液標本5ml，室溫靜 置30分鍾，1500～2000rpm離心10分鍾，收集血清於無菌螺口塑 料管中。
9.糞便標本：如患者發病早期出現腹瀉症狀，則留取糞便 標本3-5ml；
10.眼結膜拭子標本：眼結膜表麵用拭子輕輕擦拭後，將 拭子頭進入采樣管中，尾部棄去，懸緊管蓋。
其他材料：依據設計需求規範采集。
（五）標本包裝。
標本采集後在生物安全二級實驗室生物安全櫃內分裝。
1.所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍
的樣本采集管裏，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及 采樣日期。
2.將密閉後的標本放入大小合適的塑料袋內密封，每袋裝 一份標本。樣本包裝要求要符合《危險品航空安全運輸技術細 則》相應的標準。
3. 涉及外部標本運輸的，應根據標本類型，按照A類或B類 感染性物質進行三層包裝。
（六）標本保存。
用於病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測，能在24 小時內檢測的標本可置於4℃保存；24小時內無法檢測的標本則 應置於-70℃或以下保存（如無-70℃保存條件，則於-20℃冰箱 暫存）。血清可在4℃存放3天，-20℃以下可長期保存。應設立 專庫或專櫃單獨保存標本。標本運送期間應避免反複凍融。
（七）標本送檢。
標本采集後應盡快送往實驗室，如果需要長途運輸標本，建議采用幹冰等製冷方式進行保藏。
1.上送標本。
各省（自治區、直轄市）聚集性病例的標本，上送中國疾病預防控製中心病毒病預防控製所進行檢測複核，並附樣本送 檢單（見附件）。
2.病原體及標本運輸。
2.1 國內運輸。
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬於A類，對應的聯合國編號為UN2814，包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI602分類包裝要求；環境樣本屬於B類，對應的聯合國編號為UN3373， 包裝符合國際民航組織文件Doc9284《危險品航空安全運輸技術細則》的PI650分類包裝要求；通過其他交通工具運輸的可參照 以上標準包裝。
新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規 定》（原衛生部令第45號）辦理《準運證書》。
2.2 國際運輸。
新型冠狀病毒毒株或樣本在國際間運輸的，應規範包裝，按照《出入境特殊物品衛生檢疫管理規定》辦理相關手續，並滿足相關國家和國際相關要求。
2.3 毒株和樣本管理。
新型冠狀病毒毒株及其樣本應由專人管理，準確記錄毒株和樣本的來源、種類、數量，編號登記，采取有效措施確保毒 株和樣本的安全，嚴防發生無用、惡意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。
二、新型冠狀病毒的實驗室檢測
新型冠狀病毒感染的常規檢測方法是通過實時熒光RT-PCR 鑒定。任何新型冠狀病毒的檢測都必須在具備適當條件的實驗 室由經過相關技術安全培訓的人員進行操作。本指南中的核酸 檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab ， ORF1ab ） 和 核 殼 蛋 白 （ nucleocapsid protein，N）。
在實驗室要確認一個病例為陽性，滿足以下條件： 同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的 檢測結果，則需要重新采樣，重新檢測。
陰性結果也不能排除新型冠狀病毒感染，需要排除可能產生假陰性的因素，包括：樣本質量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運輸和處理樣本；技術本身存在的原因，如病毒變異、PCR抑製等。
三、實時熒光 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒核酸
（一）目的。
規範實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的工作程序，保證實驗結果的正確可靠。
（二）範圍。
適用於實時熒光RT-PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸。
（三）職責。
檢測人員：負責按照本檢測細則對被檢樣本進行檢測。
複核人員：負責對檢測操作是否規範以及檢測結果是否準確進行複核。
部門負責人：負責對科室綜合管理和檢測報告的審核。
（四）樣本接收和準備。
核對被檢樣本姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等；待檢樣本的狀態如有異常，需注明；待檢樣本應存放於-70℃冰箱保存。
（五）檢測項目。
1.新型冠狀病毒核酸測定（實時熒光RT-PCR方法） 推薦選用針對新型冠狀病毒的ORF1ab、N基因區域的引物和探針。
靶標一（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
靶標二（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
核酸提取和實時熒光RT-PCR反應體係及反應條件參考相關廠家試劑盒說明。
2.結果判斷 陰性:無Ct值或Ct≥40。 陽性：Ct值<37，可報告為陽性。
灰度區：Ct值在37-40之間，建議重複實驗，若重做結果Ct值<40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。 注：如果用的是商品化試劑盒，則以廠家提供的說明書為準。
四、病原生物安全實驗活動要求
根據目前掌握的新型冠狀病毒的生物學特點、流行病學特征、臨床資料等信息，該病原體暫按照病原微生物危害程度分 類中第二類病原微生物進行管理，具體要求如下：
（一）病毒培養。
病毒培養是指病毒的分離、培養、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、病毒凍幹以及產生活病毒的重組實驗等操作。 上述操作應當在生物安全三級實驗室的生物安全櫃內進行。使用病毒培養物提取核酸，裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒 培養等同級別的實驗室和防護條件下進行，裂解劑或滅活劑加 入後可比照未經培養的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關活動前，應當報經國家衛生健康委批準，取得開展 相應活動的資質。
（二）動物感染實驗。
動物感染實驗是指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處 理等實驗操作，應當在生物安全三級實驗室的生物安全櫃內操作。實驗室開展相關活動前，應當報經國家衛生健康委批準， 取得開展相應活動的資質。
（三）未經培養的感染性材料的操作。
未經培養的感染性材料的操作是指未經培養的感染性材料在采用可靠的方法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、 核酸提取、生化分析，以及臨床樣本的滅活等操作，應當在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人 防護。
（四）滅活材料的操作。
感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活後進行的核酸檢測、抗原檢測、血清學檢測、生化分析等操作應當在生物安全二級實驗室進行。分子克隆等不含致病性活病毒的其他操作， 可以在生物安全一級實驗室進行。
來源：國家衛健委
聲明
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