高分辨熔解曲線(high resolution melt，HRM)分析是2003年美國Utah大學Wittwer實驗室提出的一項檢測基因突變的新技術[1]。該技術利用DNA鏈中的任何突變、SNP、GC含量的改變及長度的變化等都會影響熔解曲線的Tm值及峰形的原理，在含有飽和熒光染料的體係中進行常規PCR反應，隨後在real-time PCR儀中，對產物進行升溫變性、采集熒光數據，根據熔解曲線的峰形及Tm值檢測特定的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNP)，同時也可以發現新的SNP。目前HRM分析已廣泛應用於細菌的鑒定、基因分型、重複序列分析、突變掃描及甲基化檢測等多個領域。隨著分子生物學技術的發展，大量高通量測序工作的完成，為HRM突變位點的檢測提供了新的靶點，並促進了該技術的進一步發展。
一、高分辨熔解曲線分析概述
雙鏈DNA隨著溫度升高變性形成單鏈DNA，其中50% DNA分子發生變性的溫度稱為熔解溫度(melting temperature，Tm值)。熒光染料與雙鏈DNA結合時才能夠發出熒光，當DNA變性形成單鏈時，熒光染料自DNA鏈上脫落下來，熒光信號便急劇減弱。以溫度為橫坐標對熒光信號作圖，即可得到熔解曲線。DNA鏈中的任何突變及GC含量的改變都會影響熔解曲線的Tm值及峰形。
目前HRM分析所用的熒光染料主要是飽和熒光染料，如LC GreenPlus(idaho)等。飽和熒光染料不僅與DNA有更強的結合能力並且對PCR反應無抑製作用。飽和熒光染料在飽和濃度條件下對DNA雙鏈進行標記，在升溫解鏈的過程中不會發生染料分子之間的重排，細微的序列差異即可通過熒光信號的變化體現出來。HRM的目的是能夠對單個堿基差異進行區分，因此除了對熒光染料有特殊要求外，其對real-time PCR儀要求也較高。需要PCR儀孔間溫度差異小於0.2 ℃，每步升溫0.02～0.1 ℃，而且每升高1 ℃熒光采集次數大於10次。此外，為了提高HRM檢測的靈敏度和分辨率，相關儀器還需要高能量的激發光源以檢測熔解曲線的微小變化。
HRM技術自2003年被首次提出後，一直向著高靈敏(單分子)、高通量和高效率的方向發展，目前該技術已經被廣泛應用到生物研究的各個領域中，其中在細菌感染性疾病臨床診斷中的應用主要包括細菌病原體的鑒定及耐藥性的檢測等方麵。
二、高分辨熔解曲線分析在臨床細菌快速鑒定中的應用
目前細菌感染性疾病病原學診斷的金標準仍然為培養的方法。然而傳統的培養方法耗時較長，通常不能滿足臨床診治的需求。16S rRNA基因由於其在細菌進化中的保守性，常常作為病原菌鑒定的標準標識序列。以16S rRNA基因作為靶基因進行的HMR分析技術，操作便捷、靈敏度高，且PCR反應後即可得到結果，是分子生物學技術應用於臨床菌株診斷的重要進展。近兩年來有多項研究利用PCR-HRM技術對細菌感染性疾病的病原菌進行了快速鑒定。例如，非發酵革蘭陰性杆菌是囊性纖維化或慢阻肺患者疾病發生發展的主要病原，而傳統的細菌培養鑒定方法耗時較長，為了臨床早期治療方案的合理選擇，Navratilova等[2]設計了針對16S rRNA基因4個區域的引物，建立了PCR-HRMA方法，並用該方法對來自65例患者臨床樣本純培養的275株菌進行了鑒定，結果發現PCR-HRMA的鑒別能力遠高於傳統的表型的鑒定方法。此外，對於慢生長細菌如分枝杆菌，不同種的分枝杆菌所引起的臨床症狀往往相似但其治療方案相去甚遠，因此分枝杆菌菌種的鑒定對臨床治療至關重要，而傳統的培養為基礎的鑒定方法難以滿足臨床需求。Issa等[3]用qPCR-HRM分析16S rRNA基因實現了對8種共18株分枝杆菌的快速鑒定，並為臨床合理用藥提供了可靠的依據。小腸結腸炎耶爾森菌和假結核耶爾森菌感染不僅可以引起急性消化係統炎症，還可以導致全身係統性感染。這兩種耶爾森菌入血引發的全身感染，需要選用不同的抗生素進行治療。Souza等[4]根據小腸結腸炎耶爾森菌和假結核耶爾森菌16S rRNA基因V3區140 bp片段序列的差異設計引物，利用PCR-HRM方法能夠對這兩種耶爾森菌進行鑒定，為臨床抗生素的選擇提供指導。
在感染性疾病致病機製上，同一種病原菌由於其血清型及毒力基因的不同，其致病性及治療方案也可能完全不同。針對菌株特異性序列設計引物，PCR-HRM分析對同一病原菌中不同血清型及毒力的菌株也可以進行很好的鑒別。腸道感染致病菌如沙門菌屬、誌賀菌和致病性大腸埃希菌的血清學分型是臨床診斷和疾病傳播控製的必要技術，但醫院臨床實驗室受診斷血清購買渠道和分型類別所限，難以滿足需求。PCR-HRM技術在這一領域得到廣泛應用。如結合SYBR ® Green Real-time PCR和HRM方法對5種主要的腸道致病性大腸埃希菌血清型(O26, O103, O111, O145和O157)進行鑒別診斷[5]。Banowary等[6]針對空腸彎曲菌hipO基因和大腸彎曲菌asp基因片段的差異，利用PCR-HRM分析技術實現了這兩種彎曲菌的檢測與鑒定，該技術對臨床樣本鑒定的敏感度和特異度分別是100%和92%。Ohshima等[7]將rarA和ldh基因作為HRM分析的靶基因對9種李斯特菌進行鑒定，並與16S rRNA基因測序結果進行比較，其一致率為92.6%。而以nuc和Sa442基因為靶點的HRM能夠實現對金黃色葡萄球菌的分型鑒定[8]。以16S-23S rRNA內部間隔序列為靶標的HRM分析能夠一次反映鑒別12種非結核分枝杆菌[9]。PCR-HRM分析對臨床病原菌快速、準確的鑒定，為感染性疾病的及時治療提供了極大的幫助。同時，HRM分析在疫苗研發方麵也顯示出應用前景。如腸道沙門菌腸炎血清型是人類腹瀉的主要病原菌，其主要來源為汙染的禽肉類及其製品。為了減少禽類的感染，全球多個國家使用了沙門菌疫苗菌株。為了區別疫苗菌株與野生毒株，Maurischat等利用非標記探針標記法(Unlabeled Probe High Resolution Melting, UP-HRM)針對腸炎沙門菌疫苗菌株和野生菌株nhaA和kdpA基因的序列差異設計引物，實現了兩者間的鑒別[10]。
三、高分辨熔解曲線分析在抗感染藥物敏感性檢測中的應用
抗菌藥物作用靶點基因突變是細菌產生耐藥性的主要機製之一。因此，利用HRM方法檢測與細菌耐藥相關基因的位點突變，能夠快速準確地判定病原體的耐藥性。Dona等[11]針對淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)菌株基因組特點，使用9對引物對其進行HRM分析建立了一種基於SYBGreen的HRM方法，同時實現了NG菌株的鑒定及耐藥檢測。該方法通過對193株臨床菌株的驗證發現其靈敏性和特異性與培養的方法完全一致。結核病是重要的公共衛生問題，HRM技術在結核分枝杆菌耐藥性檢測中也有較好的應用價值。結核分枝杆菌的耐藥主要與某些特定基因的突變相關。如rpoB基因突變與利福平耐藥相關，gyrA基因突變與喹諾酮類耐藥相關，katG基因與異煙肼耐藥相關。因此利用HRM技術檢測特定基因的SNP就可以快速鑒定出結核分枝杆菌的耐藥性。目前已有多項研究使用HRM技術對臨床常用抗結核藥物(利福平、異煙肼、氧氟沙星、鏈黴素及吡嗪酰胺)進行耐藥性檢測[12,13,14,15,16]。其中Galarza等使用HRM的方法檢測秘魯167株結核分枝杆菌臨床菌株中的多耐藥結核分枝杆菌並與藥敏試驗結果相比較，發現該方法對利福平耐藥的敏感性和特異性分別是98.7%和97.5%，對異煙肼耐藥菌株檢測的敏感度和特異度分別是98.7%和100%[17]。在沙門菌耐藥性檢測中，HRM通過檢測沙門菌gyrase基因的喹諾酮類耐藥決定區(quinolone-resistant determining region，QRDR)和拓撲異構酶Ⅳ基因的突變，能夠快速鑒定出喹諾酮及氟喹諾酮耐藥沙門菌[18]。此外，HRM技術也可直接檢測臨床樣本中致病菌的耐藥性，如使用HRM技術自無症狀小學生鼻咽部檢測紅黴素耐藥百日咳杆菌[19]。
細菌耐藥的遺傳基礎除了染色體介導外，更多的是質粒介導的耐藥。如質粒介導的AmpCβ-內酰胺酶(pmAmpC)是一種新型C類β-內酰胺酶，根據與染色體C類酶氨基酸序列的同源性，可分為6類(blaMOX、blaFOX、blaCMY-2、blaDHA、blaACC和blaACT)。除了介導細菌對第一、二、三代頭孢菌素、頭黴素、氨曲南的耐藥，pmAmpC甚至能夠使外膜蛋白丟失的菌株出現對碳青黴烯類的耐藥。Geyer等人分別針對6類pmAmpC基因設計引物，使用HRM技術對其進行檢測，其靈敏性和特異性分別為96%和100%[20]。
HRM技術在院內感染的監測與鑒定中也有較好的應用。Wong等[21]針對院內感染常見的5種細菌(鮑曼不動杆菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌以及MRSA)其種屬特異性基因區域分別設計引物，在一個多重PCR反應後，分析其熔解曲線，根據5種細菌PCR產物熔解溫度的不同，實現對菌株的鑒定。隨後，研究者們用150株臨床菌株對該HRM方法進行驗證，其準確性達到100%。此外，HRM的方法還可以直接監測耐藥菌株的傳播。Woksepp等[22]將連接介導PCR(LM/PCR)與HRM聯用，快速檢測了由ESBL大腸埃希菌引起的院內感染暴發。HRM在院內感染菌株的快速鑒定及耐藥菌株傳播監測中的應用，能夠有效地提高醫院的醫療質量，減少患者不必要的痛苦和經濟負擔。
近年，隨著交叉學科的發展，基於熔解曲線分析的微流控床旁一體化檢測技術已逐步從研究走向臨床。例如，可檢測呼吸道感染、血流感染、中樞神經係統感染和胃腸道感染的多種病原體靶標以及抗生素耐藥基因的FilmArray?係統。該技術利用巢式二步PCR結合熔解曲線分析，PCR產物熔解曲線提供了產物特異的"指紋圖譜"，實現多重、高靈敏度和高特異性檢測。該方法檢測一個樣本手工操作僅耗時2 min，運行時間僅為約1 h，並且在一個密閉係統中進行提取、擴增和檢測，可最大限度減少汙染。快速獲得的檢測結果所提供的必要信息有助於初級醫護人員和急診室醫生更好地對患者進行分診，並及時製定可靠的醫療決策。
四、展望
HRM自問世以來，在感染性疾病的臨床診斷中得到了廣泛的研究和評估。由於其操作簡單、結果準確、耗時短及成本低等優點，在國外已經廣泛應用於許多實驗室自建項目的臨床檢測中，基於熔解曲線分析的多重病原菌及耐藥分析一體化床旁檢測商品化係統已經麵世，為感染性疾病診治帶來創新性突破。在國內由於尚未開放臨床實驗室自建項目檢測，而價格高昂的進口商品化係統難以普及大眾，目前尚未應用於臨床標本檢測。但HRM技術在臨床細菌鑒定及藥敏檢測中具有巨大的潛力，在不久的將來必定會在細菌感染性疾病的預防與治療中發揮重要作用。
| 相關資訊: |
