前言
本標準代替GB/T 4789.3-2008《食品衛生微生物學檢驗 大腸菌群計數》。
本標準與GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下：
——修改了標準的中英文名稱；
——"第二法 大腸菌群平板計數法"的平板菌落數的選擇範圍修改為"15 CFU～150 CFU"；
——刪除了"第三法 大腸菌群Petrifilm TM測試片法"。
本標準的附錄A、附錄B為規範性附錄。
本標準所代替標準的曆次版本發布情況為：
——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗 大腸菌群計數
1 範圍
本標準規定了食品中大腸菌群（Coliforms）計數的方法。
本標準適用於食品中大腸菌群的計數。
2 術語和定義
2.1 大腸菌群 coliforms
在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞杆菌。
2.2 最可能數 most probable number，MPN
基於泊鬆分布的一種間接計數方法。
3 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
3.1 恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
3.3 恒溫水浴箱：46 ℃±1 ℃。
3.4 天平：感量 0.1 g。
3.5 均質器。
3.6 振蕩器。
3.7 無菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。
3.8 無菌錐形瓶：容量 500 mL。
3.9 無菌培養皿：直徑 90 mm。
3.10 pH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙。
3.11 菌落計數器。
4 培養基和試劑
4.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉湯：見附錄 A 中 A.1。
4.2 煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯：見附錄 A 中 A.2。
4.3 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：見附錄 A 中 A.3。
4.4 磷酸鹽緩衝液：見附錄 A 中 A.4。
4.5 無菌生理鹽水：見附錄 A 中 A.5。
4.6 無菌 1 mol/L NaOH：見附錄 A 中 A.6。
4.7 無菌 1 mol/L HCl：見附錄 A 中 A.7。
第一法 大腸菌群 MPN 計數法
5 檢驗程序
大腸菌群MPN計數的檢驗程序見圖1。
圖1 大腸菌群 MPN 計數法檢驗程序
6 操作步驟
6.1 樣品的稀釋
6.1.1 固體和半固體樣品：稱取 25 g 樣品,放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質杯內, 8000 r/min～10000 r/min 均質 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌均質袋 中，用拍擊式均質器拍打 1 min～2 min，製成 1:10 的樣品勻液。
6.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取 25 mL 樣品置盛有 225 mL 磷酸鹽緩衝液或生理鹽水的無菌錐形瓶 （瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，製成 1:10 的樣品勻液。
6.1.3 樣品勻液的 pH 值應在 6.5～7.5 之間，必要時分別用 1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl 調節。
6.1.4 用 1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1 mL，沿管壁緩緩注入 9 mL 磷酸鹽緩衝液 或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵），振搖試管或換用 1 支 1 mL 無菌 吸管反複吹打，使其混合均勻，製成 1:100 的樣品勻液。
6.1.5 根據對樣品汙染狀況的估計，按上述操作，依次製成十倍遞增係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋 1 次，換用 1 支 1 mL 無菌吸管或吸頭。從製備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 min。
6.2 初發酵試驗
每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯），36 ℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24 h±2 h產氣者進行複發酵試驗，如未產氣則繼續 培養至48 h±2 h，產氣者進行複發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。
6.3 複發酵試驗
用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36 ℃±1 ℃培養48 h±2 h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。
6.4 大腸菌群最可能數（MPN）的報告
按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的 MPN值。
第二法 大腸菌群平板計數法
7 檢驗程序
大腸菌群平板計數法的檢驗程序見圖2。
圖2 大腸菌群平板計數法檢驗程序
8 操作步驟
8.1 樣品的稀釋
按6.1進行。
8.2 平板計數
8.2.1 選取2個～3個適宜的連續稀釋度, 每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。
8.2.2 及時將15 mL～20 mL冷至46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固後，再加3 mL～4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置於36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。
8.3 平板菌落數的選擇
選取菌落數在 15 CFU～150 CFU 之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。 典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為 0.5 mm 或更大。
8.4 證實試驗
從 VRBA 平板上挑取 10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於 BGLB 肉湯管內，36 ℃±1 ℃ 培養 24 h～48 h，觀察產氣情況。凡 BGLB 肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。
8.5 大腸菌群平板計數的報告
經最後證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3中計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g （mL）樣品中大腸菌群數。例：10-4 樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取 其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105 CFU/g（mL）。
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