一、銅綠假單胞菌情況簡要介紹
銅綠假單胞菌（拉丁文名Pseudomonas aeruginosa）廣泛分布於水、空氣、土樣以及正常人體皮膚、呼吸道與腸道黏膜中，為條件致病菌。本菌為無莢膜、無芽孢、能運動的革蘭陰性菌，形態不一，成對排列或短鏈狀，為專性需氧菌，最適宜生長溫度為37℃，致病性銅綠假單胞菌該菌在4℃不生長而在42℃可以生長，據此可與熒光假單胞菌等進行鑒別，本菌生長對營養要求不高。
本菌為條件致病菌，是醫院內感染的主要病原菌之一。患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，以及術後或某些治療後的患者易感染本菌。經常引起術後傷口感染，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可導致血行散播，而發生菌血症和敗血症。燒傷後感染了銅綠色假單胞菌可造成死亡。
二、參考標準
《GB8538-2016 飲用天然礦泉水：銅綠假單胞菌檢驗》
三、檢驗原理
采用濾膜法，將250mL水樣用孔徑為0.45μm的濾膜過濾，並將濾膜移至CN瓊脂培養基上，於36℃±1℃恒溫箱中培養48h，典型菌落能夠在CN瓊脂選擇性培養基上生長並產生綠膿菌素，或者能夠在溴化十六烷基三甲銨選擇性培養基上生長並且氧化酶呈陽性、紫外光360nm±20nm照射下能發熒光，能夠利用乙酰胺產氨的革蘭氏陰性無芽孢杆菌，經證實為銅綠假單胞菌，則其檢測結果為陽性。
四、檢驗方法以及結果分析
銅綠假單胞菌檢驗程序見圖1。
圖1 銅綠假單胞菌檢驗程序
4.1操作步驟
4.1.1 水樣過濾
在100級的潔淨工作台進行過濾操作。首先用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙麵向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將250mL水樣或稀釋液通過孔徑0.45μm的濾膜過濾，然後將過濾後的濾膜貼在已製備好的CN瓊脂平板上，平鋪並避免在濾膜和培養基之間夾留著氣泡。
4.1.2 培養
將平板倒置於36℃±1℃培養24h~48h，並防止幹燥。
4.1.3 結果觀察
在培養20h~24h和40h~48h後觀察濾膜上菌落的生長情況並計數。
銅綠假單胞菌在CN瓊脂平板上為藍綠色菌落，如下圖所示：
圖2 銅綠假單胞菌在CN瓊脂平板上的菌落特征
計數所有顯藍色或綠色（綠膿色素）疑似銅綠假單胞菌的菌落，並進行綠膿菌素確證性試驗。
在紫外線下檢查濾膜時，應避免長時間在紫外光下照射，否則可能會將平板上的菌落殺滅，而導致無法在證實培養基上生長。計數濾膜上所有發熒光不產綠膿色素疑似銅綠假單胞菌菌落，並進行乙酰胺肉湯確證性試驗。
將其他所有紅褐色不發熒光的菌落進行氧化酶測試、乙酰胺液體培養基、金氏B培養基確證性試驗，培養20h~24h觀察結果，防止因為培養40h~48h導致菌落過分生長而出現菌落融合。
最終的銅綠假單胞菌菌落計數應按4.4中的公式進行計算。
在CN瓊脂上生長的菌落選擇和驗證步驟見表1。
表1 在CN瓊脂上生長的菌落選擇和驗證步驟
4.2 確證性試驗
4.2.1 營養瓊脂
盡可能將所有經濾膜過濾後，在36℃±1℃培養了20h~24h，將需驗證的可疑菌落劃線接種營養瓊脂培養基，於36℃±1℃培養20h~24h。檢查再次純化的菌落，並將最初顯紅褐色的菌落進行氧化酶試驗。
4.2.2 氧化酶試驗
取2滴~3滴新鮮配製的氧化酶試劑滴到放於平皿裏的潔淨濾紙上，用鉑金絲接種環或玻璃棒，將適量的純種培養物塗布在預備好的濾紙上，在10s內顯深藍紫色的視為陽性反應。
圖3 氧化酶試驗結果
備注：A：銅綠假單胞菌；B：陰性對照
4.2.3 金氏B（King's B）培養基
將上述呈紅褐色的且氧化酶反應呈陽性的培養物接種於金氏B培養基上，於36℃±1℃恒溫箱培養24h~5d。每天需取出在紫外燈下檢查其是否產生熒光性，將5d內產生熒光的菌落記錄為陽性。
圖4 金氏B培養基檢測結果
4.2.4 綠膿菌素試驗
取可疑菌落2個~3個，分別接種在綠膿菌素測定培養基上，置36℃±1℃培養24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解於三氯甲烷液內，待三氯甲烷提取液呈藍色時，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中並加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩後，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。
圖5 銅綠假單胞菌在綠膿菌素測定培養基中生長情況
4.2.5 乙酰胺液體培養基
將4.2.1中的純培養物接種到裝有乙酰胺液體培養基的試管中，在36℃±1℃下培養20h~24h。然後向每支試管培養物加入1滴~2滴鈉氏試劑，檢查各試管的產氨情況，如表現出從深黃色到磚紅色的顏色變化，則為陽性結果，否則為陰性。
圖6 銅綠假單胞菌乙酰胺液體培養基生長情況
備注：A：大腸杆菌；B：銅綠假單胞菌ATCC 27853；C：銅綠假單胞菌ATCC 9027
4.3 計數
將產生綠膿色（藍色/綠色）或氧化酶反應呈陽性、在紫外燈下產生熒光（4.1.3或4.2.3），且在乙酰胺肉湯中產氨的所有菌落證實為銅綠假單胞菌，並進行計數。通過計數培養後的濾膜上的菌落以獲得銅綠假單胞菌的數量，其他呈紅褐色的菌落需要進一步驗證。
4.4 結果與報告
濾膜上的特征菌落可證實為銅綠假單胞菌的菌落。計算菌落數時應考慮到驗證試驗的比例及特定的水量，過濾的水樣的體積應為250mL。
式中：
P —呈藍/綠色的菌落數；
F —顯熒光的菌落數；
cF—產氨陽性的顯熒光菌落數；
nF—進行產氨測試的顯熒光菌落數；
R —呈紅褐色的菌落數；
cR—產氨、氧化酶、金氏B培養基上顯熒光測試均呈陽性的紅褐色菌落數；
nR—進行產氨、氧化酶、金氏B培養基上顯熒光測試的紅褐色菌落數。
根據藍色或綠色菌落的計數（4.1.3）和確證性試驗的結果（4.2），計算每250mL水樣中的銅綠假單胞菌數量，結果以CFU/250mL計。
4.5 其他
如銅綠假單胞菌汙染嚴重或培養時間過長時，菌落可能蔓延而影響計數。
檢驗及計數過程中應以銅綠假單胞菌標準菌株作為陽性對照菌株，以熒光假單胞菌標準菌株作為陰性對照菌株。
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