一、大腸菌群簡介
有關大腸菌群，《GB 4789.3-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》中是這樣定義的：“在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞杆菌”。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸杆菌、產氣克雷伯氏菌和陰溝腸杆菌等。
二、檢驗程序
對於大腸菌群的檢驗，《GB 4789.3-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》中提供了兩種方法，MPN法和平板計數法。其中MPN法采用了兩步發酵的方法，檢驗程序如下（圖1）。本文主要對兩步發酵方法中使用的兩種培養基進行對比和討論。
圖1 大腸菌群 MPN 計數法檢驗程序
三、培養基比較
檢測過程中所用的兩款培養基，LST和BGLB比較如表1。
表1 LST和BGLB培養基的比較
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培養基 |
LST |
BGLB |
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中文名稱 |
月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯 |
煌綠乳糖膽鹽肉湯 |
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英文名稱 |
Lauryl Sulfate Tryptose Broth |
Brilliant Green Lactose Bile Broth |
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用途 |
用於大腸菌群、大腸杆菌的測定。 |
用於大腸菌群的確證試驗。 |
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配方（g/L） |
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檢驗原理 |
胰蛋白腖在培養基中作為營養物質提供菌體細胞生長所需要的氮源、維生素、氨基酸及生長因子等；乳糖是可發酵的糖類，提供菌體細胞生長所需要的碳源；氯化鈉維持體係滲透壓平衡；磷酸鹽為菌體生長提供相對穩定的酸堿緩衝體係；月桂基硫酸鈉抑製非大腸菌群類細菌的生長。 |
蛋白腖提供碳氮源；乳糖是可發酵的糖類；牛膽粉和煌綠抑製非腸杆菌科細菌。 |
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用法 |
稱取本品35.6g，加熱溶解於1000 mL蒸餾水中，分裝到有小倒管的20 mm×150 mm試管中，每管10mL，121℃高壓滅菌15分鍾，備用。 |
稱取本品40.0g，加熱攪拌溶解於1000 mL蒸餾水中，分裝到有倒立發酵管的20 mm×150 mm試管中，每管10 mL，121℃高壓滅菌15分鍾，備用。 |
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培養條件 |
36℃±1℃培養48h±2h |
36℃±1℃培養48h±2h |
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質量控製和典型特征 |
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大腸埃希氏菌 |
渾濁度2，氣體充滿管內1/3 |
渾濁度2，氣體充滿管內1/3 |
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弗氏檸檬酸杆菌 |
渾濁度2，氣體充滿管內1/3 |
渾濁度2，氣體充滿管內1/3 |
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陰溝腸杆菌 |
渾濁度2，氣體充滿管內1/3 |
渾濁度2，氣體充滿管內1/3 |
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鼠傷寒沙門氏菌 |
渾濁度2，不產氣 |
渾濁度2，不產氣 |
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金黃色葡萄球菌 |
渾濁度0（不生長） |
渾濁度0（不生長） |
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糞腸球菌 |
渾濁度0（不生長） |
渾濁度0（不生長） |
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質控圖片 |
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產品選擇 |
HB0102 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯（LST） HB0102-3 雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯（LST） HBKD0102 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯（LST）顆粒 HBKP0102 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯（LST）（顆粒） HBPT017 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖肉湯LST管（單料，含小倒管） HBPT017-1 月桂基硫酸鹽蛋白腖肉湯LST管（雙料，含小倒管） |
HB0104 煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） HBKD0104 煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)顆粒 HBKP0104 煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)（顆粒） HBPT021 煌綠乳糖膽鹽肉湯BGLB（含小倒管） |
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從表格中可以看出，這兩種培養基中都含有乳糖，大腸菌群類的細菌都能利用這兩種培養基發酵乳糖產生氣體，使用方法也相同。但兩者選用的抑菌劑不同：LST中月桂基硫酸鈉是抑菌劑，抑製非大腸菌群類細菌的生長，而BGLB中則采用了牛膽粉和煌綠抑製非腸杆菌科細菌的生長。
兩者選用的質控菌株一樣：大腸菌群類細菌都能生長良好且產生氣體，而沙門氏菌則隻能生長，不會產生氣體。
四、討論
（1）因為這兩種培養基選用的質控菌株完全一樣，試驗現象也完全一致，導致經常有人會問：隻用LST進行發酵不行嗎？為什麽要用兩步發酵？
首先，兩步發酵都利用了乳糖發酵管進行了兩次發酵試驗，培養基的配製略有不同，但都是為了證實培養物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產酸產氣”。
初發酵試驗也叫推測試驗：樣品稀釋後，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯，36℃±1℃培養48 h±2 h，觀察是否產氣。
複發酵試驗也叫證實試驗：將產氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36℃±1℃培養48 h±2 h，觀察是否產氣，以BGLB產氣為陽性。
初發酵是樣品的發酵結果，不是純菌的發酵試驗，所以初發酵陽性管經過後麵的證實試驗，有可能成為陰性。初發酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌。有數據表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，推測試驗與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。
類似兩步發酵、兩步增菌、同時用多種培養基對同一樣品進行增菌分離的情況還有很多，通常來說，但凡標準裏麵這樣要求，一定有其道理和必要性，所以建議操作人員嚴格按照標準程序進行檢驗，不要總想走捷徑，使檢出的結果不符合實際情況。相關文章可參考：
（2）產氣量的判斷
實驗表明，大腸菌群的產氣量，多者可以使發酵倒管全部充滿氣體，少者可以產生比小米粒還小的氣泡。在乳糖發酵試驗工作中，經常可以看到在發酵倒管內極微少的氣泡（有時比小米粒還小），有時可看到在初發酵時產酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。如果對產酸但未產氣的乳糖發酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產生，並作進一步試驗。
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