（2）核酸的分子雜交
前麵已經談到，親緣關係相近的微生物，其DNA堿基比相同或相近。反之則不然，也就是說，DNA堿基比相同或相近的微生物，其親緣關係並不一定相近。這是因為DNA堿基比的相同或相近並不反映堿基對的排列順序相同或相近，而微生物間的親緣關係主要取決於它們堿基對的排列順序的相同程度。因此，要確定它們之間的親緣關係就要進行核酸的分子雜交試驗，以比較它們之間堿基對序列的相同程度。核酸的分子雜交試驗在微生物分類鑒定中的應用主要包括DNA—DNA分子雜交和DNA—rRNA分子雜交等方法。
①DNA—DNA分子雜交：該方法的基本原理是利用DNA雙鏈解離成單鏈（變性 ），單鏈結合成雙鏈（複性），堿基配對的專一性，將不同來源的DNA在體外解鏈，並在合適的條件下使單鏈中的互補堿基配對結合成雙鏈DNA。然後根據能生成雙鏈的情況，測定雜合百分比。如果兩條單鏈DNA的堿基序列完全相同，則它們能生成完整的雙鏈，即雜合率100%；如果兩條鏈的堿基序列隻是部分相同，則它們生成的“雙鏈 ”含有部分單鏈，其雜合率小於100%。因此，雜合率越高，表示兩個DNA之間堿基序列的相似性越高，說明它們之間的親緣關係也就越近。許多資料表明，DNA—DNA雜交最適合於微生物種一級水平的研究。根據約翰遜1981年的試驗指出，DNA—DNA雜交同源性在60%以上的菌株可視為同一個種，同源性低於20%者為不同屬的關係，同源性在20—30%之間可視為屬內緊密相關的種。
核酸的分子雜交的具體測定方法很多。按雜交反應的環境可分為液相雜交和固相雜交兩大類，前者在溶液中進行，後者在固體支持物上進行。在這些方法中，有的需要用同位素標記的DNA，有的則用非同位素標記。在細菌分類中，常用固相雜交法進行測定。這種方法的大致做法是：將未標記的各微生物菌株的單鏈DNA預先固定在硝酸纖維素微孔濾膜（或瓊脂等）上，再用經同位素標記的參考菌株的單鏈DNA小分子片段在最適複性溫度條件下與膜上的DNA單鏈雜交；雜交完畢後，洗去濾膜上未配對結合的帶標記的DNA片段；然後測定各菌株DNA濾膜的放射性強度。以參考菌株自身複性結合的放射性計數值為百分之百，即可計算 出其他菌株與參考菌株雜交的相對百分數。這些百分數值即分別代表這些菌株與參考菌株的同源性或相似性水平，並以此數值來判斷各菌種間的親緣關係。
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